菌种制及保藏

概念：食用菌、大型真菌、蘑菇、蕈（菌）食用菌（ediblefungi）：是指可供人类食用的大型真菌，通称蘑（mushroom）。蕈菌：中国古代把生长在木上的蘑菇称作“菌”，而把土中生长的称作“蕈”。由于“蕈”在汉语里有泛指能产生子实体的大型真菌之义，故现在也常将蘑菇称为“蕈菌”。日文汉字中则用“菌蕈”作为蘑菇的同义词。第一节引言一、菌种学研究的对象与任务菌种(Spawn)：经人工培养并进行扩大繁殖，可用于生产的菌丝体。在蘑菇（蕈菌）学英文文献中，在谈及菌种问题时，常用Spawn一词。Spawn一词在韦氏(Wabster‘s)大辞典中的定义为：“真菌的菌丝体，尤指食用蘑菇的用以进行繁殖的菌丝体。”因此，蘑菇学中的所谓菌种，系指在适宜基质上发育良好并已充分蔓延，可用作蘑菇生产的种源的菌丝体。从广义上讲:菌种，顾名思义，就是微生物的可作进一步扩大繁殖之用的种子。根据各类微生物的特点，可以选用不同发育阶段的菌体作为菌种。例如：细菌是形态简单，多以裂殖方式进行繁殖的微生物，常直接用营养体作为菌种，放线菌常用孢子作为菌种，而异宗结合蕈菌（大型真菌）的单核菌丝体一般不具备结实能力，所以必须采用具结实能力的双核菌丝体作为生产用种。菌种学：食用菌菌种学是研究食用菌菌种生产、保藏及应用的原理和技术的科学。菌种学是一门实践性很强的学科，其任务在于：1.探明在保持优良菌种原有种性的条件下，扩大繁育菌种的有效途径和基本原理；2.探讨并完善适合生产力发展需要的菌种制作、保藏及合理应用的一系列技术与方法；3.指导制种实践，不断提高食用菌制种及栽培的技术水平和生产水平。二、菌种制作技术发展简史古代劳动人民在长期的生产实践中。很早就开始在菌种保存和利用方面进行探索。在我国，一千四百多年前北魏贾思勰所著《齐民要术》中，已有关于制曲法的详细记载。从微生物学观点来看，曲既是发酵的种子或酿造的酶制剂，也是以干燥形式保藏酿造用的微生物制品。

我国是最早利用天然基质上的食用菌菌丝体、子实体或空中散布的孢子作菌种进行半人工栽培的国家。唐代韩鄂所著《四时纂要》中记载了“种菌子”的方法：“取烂构木及叶，于地埋之。常以泔浇令湿，两三日即生。”这是利用已长有构菌即金针菇的菌丝体的构木进行金针菇栽培的最早记载。

元代王祯所著《农书》中关于“经年树朽，以辈碎剁、匀布坎内”的描述，表明我国菇农早在距今约800年前即已懂得利用子实体作菌种进行香菇栽培了。至今仍在我国南方数省少数地区流行的香菇“砍花法”栽培，则是精心选择和利用适宜的地形、植被、气候、基质等条件，借助天然孢子作种源进行菇类栽培的一个典型例子。

虽然人类栽培菇类的历史可追溯到一千多年以前，但是，科学的用纯培养技术生产菌种还只有一百多年的历史。栽培范围遍及全世界、产量居各种菇类之首的双孢蘑菇的制种技术发展史，可以作为蕈菌菌种制种技术发展史的一个代表。

从法国路易十四(1683-1715）蘑菇栽培的初始阶段到现在，双孢蘑菇的栽培已达三个多世纪，在这漫长的历史过程中，双孢蘑菇菌种的制作技术经历了三个主要阶段(郭德章，1994)。1．天然菌种阶段在蘑菇栽培的初期，法国菇农采用从长过蘑菇的草地中挖取的土块或厩肥作为菌种进行蘑菇栽培。这种天然菌种可靠性很差，因此这个时期的蘑菇生产常常面临着失败的威胁。2.粗放式菌种阶段

这个阶段曾出现过两种较有代表性的蘑菇菌种。其一是将双孢蘑菇菌丝移植到发酵过的堆肥中，待堆肥长透菌丝后，将之风干制成片状，称之为“片状菌种’(flakespawn)。这种片状菌种曾在法国盛行一时，又称‘法国菌种”。

十八世纪，双孢蘑菇栽培传入英国，英国人发明了另一种形式的菌种即所谓“砖式菌”(brickspawn)。其制作方法是将湿的极细的厩肥放入模子中压成块状，按入蘑菇菌丝，长透后将之压成碎块，撒于菇床上。砖式菌种又称“英国菌种”。虽然这两种菌种能较可靠地用于接种，但因为它们是粗放的、非纯培养技术的产物，所以难免遭受病虫侵染，蘑菇的单产仍然很低。这种粗放式菌种一直沿用到十九世纪末期．3．纯菌种阶段

1894年，法国巴黎的巴斯特研究所制造出世界上第一批双孢蘑菇纯菌种。但这一技术一直秘密掌握在法国人手中长达十余年之久。二十世纪初，达格尔（Duggar)研究并公布了用组织分离法培养双孢蘑菇纯菌种的方法，并开创性地在蘑菇制种中引入了牛奶瓶。瓶式蘑菇纯菌种的出现标志着世界蘑菇栽培进入了一个崭新的阶段，蘑菇产量显著提高。瓶式“美国菌种”一直沿用到今天。

其他食用菌的菌种制作，也都经历了类似的由粗放到精致，由天然菌种到纯培养菌种的发展过程。例如，就约在距今300年前由中国人最早开始栽培的草菇面言，将长透菌丝的稻草风干留种的技术曾一直沿用到本世纪中叶。

在纯培养菌种诞生之后，人们并没有停止改善菌种制作技术的步伐。半个多世纪以来，种型的改革不断取得进展。

1932年，辛登(Sinden)发明了谷粒菌种(grainspawn)。

1960年代，麦粒菌种因其具有菌丝生长健旺，透播性好，发育点多面均匀很快风行于全世界。

1970年代初，以颗粒状珍珠岩为原料，添加麦麸等营养物质制作蘑菇菌种获得成功。颗粒菌种(granularspawn)：

1980年代，世界各地出现了许多人工工艺制成的颗粒型菌种培养基，其共同特点是：采用木屑、秸秆、堆肥、塘泥、腐殖土等适合蘑菇生长的材料，经粉碎后用机器压制成均匀的颗粒用于制种因此用此法制得的菌种被称之为颗粒菌种(granularspawn)。颗粒菌种具有透播性好，比麦粒菌种的抗高温、抗氨性能强，保存时间长等优点，又适于机械化生产，具有广阔的发展前景。

“种驹”：在香菇制种方面，在木屑种诞生之后，又陆续出现了便于段术接种且可长途邮寄的木质或人工培养料压制而成的圆柱形菌种，日本人称之为“种驹”。伴随着各种新的、便于工厂化生产的种型的出现，菌种制作的机械化以至自动化程度愈来愈高，生产规模也日益扩大。菌种公司：质量高、信誉好、规模大、机械化

目前，在欧，美，日等发达国家，菌种制作的整个过程，从原料准备到灭菌处理，从环境控制到产品包装，原来靠手工进行的各项操作，几乎已完全由各种精巧的机械及自动控制的仪表所取代。同时，一个大区域以至整个国家的菌种供应，由为数不多的几家质量高、信誉好、规模大的菌种公司所承揽，已日益成为一种普遍的趋势．小结：食用菌菌种发明年鉴1、双孢菇菌种1894年（法国），纯种问世；1902年，组织分离法获得纯种；美国人制得瓶式菌种。1932年，辛登(Sinden)发明了谷粒菌种(grainspawn)。谷粒菌种亦称麦粒菌种。2、香菇菌种1935年,日本人(森喜作)开始研制香菇木屑种1942年，获得成功三、菌种学在学科及产业发展中的作用菌种学与微生物学等相关基础学科有紧密联系，与蕈菌学内的遗传学、育种学、栽培学等分支学科之间的相互关联，相互促进，更是显而易见的。食用菌纯菌种培养技术的创立和完善无疑离不开微生物学纯培养理论与技术的发展，反过来，利用子实体、菌核等组织分离培养纯菌种，制作银耳及其伴生菌“香灰菌”的“混合菌种”等具有蕈菌特色的制种技术的发明，也是对整个菌种学理论与技术的充实和完善。食用菌遗传学、育种学理论与技术的发展为优良菌种的制作提供必不可少的技术基础，而菌种制作技术的改进，也为遗传育种成果--各种优良菌种种性的保持和合理利用创造了必要条件。菌种学与栽培学的关系尤为密切。在很大程度上正是高产优秀栽培的实际需要向菌种学提出了新的任务与要求，从而促进了菌种制作技术的发展。例如，银耳由传统的段木栽培改为袋栽后，银耳菌种的制作在培养基质、种型、适宜的香灰菌的选择上都作了相应改进，以适应袋载技术的要求。

当然，制种技术的每一项革新，也会在不同程度上促进栽培技术的改进和提高。例如，我国的香菇代料栽培曾经历一个较长时期的“挖瓶压块”阶段。这一方法的特点是用木屑培养料培养瓶装“栽培种”，待菌种成熟后，从瓶内挖出制成供出菇之用的“菌块”。

这种挖瓶制块的栽培方式手续繁琐，颇为费时费力。人们从改革制种容器入手，将瓶装菌种改为袋装菌种，进而取消“制块”程序，将培养至生理成熟的“菌种袋”直接置条件适宜的田间或室内出菇，这就是香菇的“菌筒栽培”或“人造菇木”栽培。因此可以说，香菇菌筒栽培是在菌种制作技术作相应改革的基础上才得以确立并逐惭完善的。

又如，双孢蘑菇麦粒菌种的出现，解决了长期困扰菇农的粪草菌种无法“透播”的问题，由于麦粒菌种发育点大为增加，菌丝“走菌”均匀，彻底，产量比使用粪草菌种显著增加，使蘑菇的栽培技术水平上了一个新台阶。透播：是指将菌种均匀地分布到培养料中的接种方法。

菌种学的发展不仅对相关分支学科以至整个蕈菌学（蘑菇学）的发展发挥了积极作用，而且，作为一门实践性很强，直接为食用（蕈）菌业服务的学科，菌种学及菌种制作体系的发展也对蕈菌业的发展起着重要的推动作用。食用（蕈）菌业能由数十年前很不起眼的农村家庭副业发展成今天年总产值逾100亿美元的全球性综合产业，没有规模日益增大，技术日臻完善的菌种制作体系，是不可想象的。

近20年来，我国的食用（蕈）菌栽培业发展十分迅速，在80年代初到80年代末的短短不到十年的时间里，迅速由一个在世界菇类总产中所占比重甚小的国家一跃而为占世界总产一半以上的头号食用菌生产大国。这种突飞猛进的发展当然令人欢欣鼓舞。但是，与此同时，我们还应清醒地看到，如果就以单产为代表的栽培水平及以单价为代表的经济效益而论，我国与先进国家相比，还有明显差距。例如：荷兰、法国的双孢蘑单产达25-30公斤/m2，而我国的单产仅10公斤/m2左右。香菇的国际市场售价，日本产品通常可比中国产品高出二倍之多。造成如此巨大的差距的原因固然很多，但我国的育种水平较低，制种质量较差无疑是重要原因之一。为了使我国的食用菌生产在产量稳居世界第一的条件下，在产品质量、经济效益方面迈上一个新的台阶，努力推进包括菌种学在内的各有关学科理论研究及实用技术水平的提高，是一个刻不容缓的任务四、菌种制作与食用菌栽培的关系

1、栽培需要菌种，从而促进制种技术的发展。

2、菌种技术的每一项革新都促进栽培的改进和提高。

3、提高EM育种水平和制种质量，强化菌种生产与流通管理，向更高、更新的目标迈进。第二节生产场所及设备简介一.菌种厂的规划与布局菌种厂是从事蕈菌纯培养菌种生产的场所。为了提高菌种的成品率，必须从筹建菌种厂起就注意到场地和建筑物规划和布局的科学性。

菌种厂的规划：所谓菌种厂的规划指菌种厂筹建的规模大小，包括分期规模和最终规模，厂房位置的确定以及与建厂规模和制种工艺相适应的投资设备，建筑物的设计及具体要求等。

菌种厂的布局：所谓布局是指根据所确定的生产规模和工艺流程，对厂房的各个部分及相应的设备、配套设施等进行合理安排．(一)、菌种厂规划的基本原则1.以销定产，设备配套根据当地蕈菌栽培的种类、资源及产品销售行情确定菌种厂的规模，并按各季菌种生产量规划厂房各部分的面积，按各部分面积大小和生产量选择适量的规格型号适宜的设备。

2.有水有电，交通方便菌种生产无菌操作的特点要求菌种厂有一个较为洁净的周边环镜，因此菌种厂不宜设在人口稠密的居民区。但是，菌种厂也不宜设在过于偏僻的地方。无论是哪一级菌种厂，具备通水通电、交通方便这一基本条件，对于维持正常生产，扩大销售，降低成本，都是必不可少的。3．因地制宜确定制种级别

优良菌种的生产和供应有赖于不断选育出适应各种不同需要的高产优质新菌株。但是，良种选育是一种对人员素质、设备条件、种质资源的积累、工作的连续性等都有很高要求的研究工作，一般说来，菌种生产厂试图投入少量人力、物力及财力“兼顾”这一工作，很难取得成效。不仅如此，由于在菌种生产中，前一级菌种是后一级菌种的种源，因此，前一个级别的菌种出现质量问题比后一个级别菌种出现质量问题危害更大。因此对生产和供应较前级菌种的厂家的条件和责任就应提出更高的要求。目前，我国农业部已经颁布包含这方面内容的菌种管理行政法规。今后，各菌种厂在制定规划时，应根据本身的技术力量及设备条件，确定适宜的菌种生产级别。(二)、菌种厂的平面布局菌种厂应根据微生物易于在空气中传播及其传播的特点规划厂房，布设流水线，以使制种的工艺流程既便于流水作业，节约劳力和投资，又有利于对微生物传播的控制，提高菌种生产的成品率。下面分别介绍简易菌种厂和规范化菌种厂的平面布局。

1．简易菌种厂：这种菌种厂适宜建立在乡镇，年菌种生产量10万瓶以内。规划时应注意如下几点：(1)每日菌种生产量应与冷却室、按种室，培养室的面积相适应。没有空调设备的乡村菌种厂，其每日菌种生产量与冷却室，接种室和培养室的适宜比例大约为500：5：l：36。就是说，一个每日生产量为2000瓶(袋)的菌种厂，冷却室约需日20m2，按种室约需4m2,培养室约需144m2。其中培养室内需设置6层培养架，培养架占地面积为培养室总面积的65％左右。(2)培养基制作、灭菌、冷却、接种应当一条龙流水作业。(3)冷却室和接种室在条件不允许情况下可以两室合用，冷却后用塑料膜在室内架起临时接种室进行接种。(4)筹建菌种场时资金使用的重点应放在灭菌、冷却、接种三处的设备和室内标准化设置上。(5)原料仓库，特别是粮食类的原料仓库应当远寓培养室、接种室和冷却室，若有栽培场，也应远离以上各室，避免杂菌传播。同时，仓库晒场位置还应选择在接种、冷却、培养室的东西方向。以减少杂菌对以上各室的传播机会。

2．规范化菌种场：所谓规范化菌种场是指严格地按微生物传播规律建立起来的菌种场，它除了设备较齐全，人员素质较好外，布局上严格按有菌区和无菌区划分，无菌区又有高度无菌区和一般无菌区之分。其工艺特点是：

(1)该工艺按培养基制作--灭菌--冷却—接种—培养的程序流水作业。菌种场的建筑结构：室内要求水泥地面、四周墙壁洁净，不易沾染霉菌孢子，不易吸湿。保持壁上干燥且便于冲洗。空气过滤除菌设备是空气净化措施中采用的现代化设备，如实验室常用的超静工作台、生物安全箱、无菌室等。即使空气通过孔隙小于0.2μm的高效过滤器，利用物理阻留、静电吸附等原理除去介质中的微生物，使无菌室或超静工作台内的空气达到净化的目的。(2)培养基制作室和其他仓库实验室为有菌区，冷却室、按种室和培养室为无菌区，其中冷却室、接种室为高度洁净的无菌区，要求空气净化程度达到100级。不过，已有试验表明，由于微生物的分生孢子、粉孢子、节孢子等的直径比100级净化所规定的尘埃粒子的直径更小，所以即使达到了100级净化标准，要进行有效的开放式接种，还需辅以其他设备（超净工作台）或者消毒措施。超净工作台洁净度：１00级按照国家标准，凡是达到≥0.5μm的尘埃的量≤3.5粒/L时，空气洁净度为１00级。表示环境中无尘无菌。在达到100级净化标准的条件下，要进行有效的开放式接种，还需辅以其他设备（超净工作台、接种箱等）

(3)灭菌锅应是双门的，一门与有菌区(培养基制作室)相通，另一门与无菌区(冷却室）相通，双门不能同时开放。(4)冷却室、接种室要求作水磨石或油漆地面，四周墙壁和天花板油漆防潮，安装空气过滤装置。冷却室配备除湿和强制冷却装置。接种室配备分离式空调机。

(5)培养室要有足够的空调装置，保证高温季节能正常生产。(6)工作人员必须具有一定微生物常识，经过严格无菌操作训练，进入无菌区前须淋浴更衣。(7)菌种灭菌后的运输工具一经运出接种室，必须灭菌或消毒后，方可进入无菌区使用，其他工具或用品也应如此。冷却室、接种室、培养室均采用拉门结构，减少开关式门扇启动过程的空气流通。整个无菌区要求密闭性能良好图11-4瓶栽金针菇(8)保持冷却室、接种室的气压为正值，其中接种室气压又要大于冷却室，冷却室大于缓冲室和培养室。(9)原料、特别是粮食类原料是许多杂菌的主要菌源，因此，原料仓库应远离冷却室、接种室和培养室。(10)培养试验场与制种场应当分开，不能同在一处或处于相距很近的地方。否则栽培场杂菌易传入制种场。二.菌种厂的基本设备及常用物品一个合格的菌种厂除应有合理的布局之外，还要配置必要的生产设备。生产设备的选型配套将决定菌种厂的生产能力，并与菌种质量有密切关系。此外，菌种厂在日常生产中，要消耗大量玻璃器皿、塑料袋、消毒药品等低值易耗品，注意选用质量合格、价格适宜的这类物品，对于维持生产的顺利进行，降低成本，都有一定的意义。(一)、基本设备

装料设备

1．拌料机拌料机是将木屑等原料加以搅拌混合的机械。它不仅能提高生产效率，而且可减少干料人工搅拌中的尘量并减轻劳动强度。目前我国福建等地推广应用较多的MJ-70型拌料机的主要技术指标是：(1）生产率800-1000kg／h。(2)配套动力3KW电动机。(3)传动方式三级A型三角皮带传动。

2．装料机装料机是将已拌匀的培养料装入制种容器的机械，具有结构筒单，操作方便、功效高等优点。有的装料机仅具装袋功能，有的则可装瓶装袋两用。目前推广应用较多的ZDP-3型装瓶装袋两用机的主要技术指标是；(1)生产率300-400瓶／h或400-500袋／h。(2)配套动力750W单相电动机。(3)规格、重量800×600×400mm，50kg.拌料机装料机消毒、灭菌设备

在菌种制作过程中，必须对培养基、接种工具及其他用品、接神室、培养室等工作场所进行可靠的灭菌或消毒。消毒、灭菌设备就是利用热力、射线等杀菌手段进行消毒或灭菌的设备。目前，一般菌种厂常用的消毒灭菌设备主要是用于培养基、玻璃器皿灭菌的蒸汽或干热灭菌器以及用于工作场所消毒的紫外线杀菌灯。1．蒸汽灭菌设备

蒸汽灭菌设备是利用其产生的湿热蒸汽进行灭菌的设备。根据所产生的蒸汽压力及工作性能可分为如下两类：(1)高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅是利用锅内高压高温蒸汽进行灭菌的设备。

电热高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅(2)常压蒸汽灭菌灶目前，在我国部分乡村菌种厂，由于受到电力供应、设备投资等条件的限制，高效、可靠的高压蒸汽灭菌设备的使用尚末完全普及，自制的、用煤、柴等作能源产生蒸汽进行灭菌的常压蒸汽灭菌灶的应用还比较普遍。灭菌灶用砖和水泥构筑，盛水容器为直径80-100cm的铁锅。灶体体积大小不等，容量1.5—3m3，可装600-1000瓶。蒸汽工作压力与蒸汽温度的关系高压蒸汽灭菌：15psi=1.05kgf/c㎡=103.4kPa=0.10MPa，121℃；20psi=1.41kgf/c㎡=137.9kPa=0.14MPa，126℃；25psi=1.76kgf/c㎡=172.6kPa=0.17MPa，130℃；30psi=2.11kgf/c㎡=206.8kPa=0.21MPa，135℃；

常压蒸汽灭菌：1atm，100℃设计的主要技术要求是:灶体大小依生产规模而定，视需要配置1-2口盛水锅。灶仓砌墙范围比锅的直径宽20cm左右，灶仓内墙壁用水泥精细粉刷，灶顶圆拱形，以使蒸汽冷凝水沿仓壁下流，防止打湿灭菌物品。灶仓内要有层架，以便分层装入灭菌物品。具有湿度测试装置，一般放在灶体中部小门中间。具有加水装置及观察或测试灶内水量的装置。

2．干热灭菌箱干热灭菌箱是利用箱内加热产生灼热空气进行灭菌的设备，主要用于吸管、培养皿等不宜灼烧，用时需保持干燥状态的玻璃器皿的灭菌。干热灭菌箱也配有自动控温装置。加热温度在200℃以上的电热恒温干燥箱均可供干热灭菌之用。

3．紫外线灯紫外线灯是接种室、接种箱等场所常用的消毒设备，可单独应用，也可与化学消毒剂配合使用。与遗传育种中用于诱变时常采用低功率(15瓦左右)紫外灯不同，用于消毒时需采用较高功率的紫外线灯。菌种厂消毒用紫外线灯的功率通常为30-40瓦。X—射线、γ—射线等电离射线虽可用于灭菌，但因这类射线的产生需要昂贵的专用设备，无法在菌种生产中应用。微波灭菌技术近年，在蕈菌生产中，还出出了一些用新的方法进行灭菌的尝试。例如，波长1000μm—1000mm电磁波（微波）的电场对微生物细胞中的水分子能产生极化作用，极化后的水分子会随微波电场方向的改变而转动，在转动过程中分于之间的高速摩擦产生热能，这种热能不同于外部加热，可在物体本身的温度权略微增加的情况下使微生物细胞暴破，从而达到灭菌的目的。电子消毒、灭菌技术以“高效臭氧发生管”为核心部件的所谓电子消毒、灭菌器，利用高压放电原理，使空气中的氧电离，生成游离的氧原于，并与空气中的氧结合形成臭氧气体。臭氧是一种强氧化剂，具有强烈的氧化作用的臭氧迅速扩散并深入掺透到微生物细胞壁内之后，能使菌体蛋白变性并破坏菌体的酶系统，从而使微生物细胞失去活力。

从理论上讲，上述灭菌方法均不无道理，但总的说来，这些新的消毒、灭菌方法尚处于试验、探索阶段。一系列实际问题，例如，其实际使用效果及适合范围究竟如何，设备的结构及功能应作哪些改进等等，都有待在今后的实践中研究解决。接种室及接种设备1．接种室接种室是用于接种的无菌操作室2．接种箱接种箱是一种由木质箱体及可以启闭的玻璃窗构成的接种装置制作筒便，造价低廉，由于体积较小，相同条件下空气消毒的效果优于接种室。3．超净工作台超净工作台是一种通过过滤除去空气中的尘埃使空气净化的装置。超净工作台接种室与接种箱培养室及培养设备1．培养室培养室是对菌种进行保温培养的房间。2.培养箱培养箱是培养试管菌种及其他供试验研究用的少量菌种的常用设备.

(二)、常用物品除需上述基本设备外，菌种生产还需耗费大量多属低质易耗类的物品。主要有如下几种：1．制种容器一级斜面菌种多用18×180mm的试管，双孢蘑菇、草菇菌种所用试管通常略微大些，20mm×200mm即可.二、三级菌种过去均采用750ml玻璃菌种瓶，由于玻璃菌种瓶有容易破损、运输不便等缺点，直接供应菇农的三级栽培种有日惭改用塑料袋的趋势.2.消毒药剂3.接种工具第三节生产流程与菌种类型一.菌种生产流程

(一)、菌种生产的一般工艺流程到目前为止，无论国内还是国外，真正具有商业意义的各种菌种，基本上都是采用固体基质培养制作的。由于将用一级斜面菌种扩制而得的二级菌种直接用于生产，通常在数量上难以满足实际需要，所以往往需再行扩制一次，固此菌种生产一般分三级进行。

1.

试管种的制作流程

PDA分装加棉塞灭菌(121℃30min)摆斜面接种培养质检保藏冷却至60℃

木屑(78%)

麸皮(20%)

石膏(1%)

蔗糖(1%)

水适量(55%-65%)

装瓶(袋)加棉塞灭菌冷却接种培养质检二(三)级种的制作流程三、各级菌种的培养时间

1、试管种7-10天2、二级种30-60天3、三级种30-60天

枝条种装瓶

二(三)级种装瓶利用周转筐装载菌种瓶（袋）灭菌(二)、全年菌种生产的分期安排一般说来，欧美各国菌种生产厂家在制种所涉及的菇类、生产条件等方面，情况都比较相似，这是因为：1.欧美各国的菌种生产基本上是以双孢蘑菇为单一对象的.2．无论是蘑菇的栽培还是制种，机械化及环境条件自动控制的水平都日益提高，已很少受季节、气候条件的制约。3．菌种生产不由成百上千的中小厂家分散生产，而由少数大公司集中垄断。

相比之下，我国的菌种生产状况要复杂得多，从而与上述欧美各国的情况形成了巨大的反差；1．我国是世界上栽培食用菌的种类最多的国家。2.我国的食用菌（蕈菌）栽培还处于以依靠自然气温为主的状态，即使是菌种生产也在很大程度上无法完全摆脱气侯条件的影响。3．我国幅员辽阔，加之栽培主要依靠自然气温，使得同一菇类的接种期在不同地方可能相差颇大。

4．我国的菌种生产尚处于大、中、小并存，以小型厂家为主的局面。不同地区以至同一地区不同档次厂家之间，生产条件相差很大。

在制定分期及全年的生产计划时，应注意如下几点：

1.及时制种,不违农时.2.突出重点,统筹安排.3.忙闲有序,均衡生产.全年菌种生产时间安排时间香菇2-4月8-9月木耳3-4月2-3月(春)8-9月(秋)银耳3-4月3-4月(春)9-10月(秋)金针菇11-1月侧耳类2-4月(春)8-10月(秋)猴头菇3-4月(春)8-9月(秋)双孢菇9-10月草菇6-8月(华中)4-10月(华南)名称段木袋料二.菌种的分级与种型

(一)、菌种的分级在中国的蕈菌生产中，菌种制作通常分三步进行。用自行分离或外购的试管菌种扩大繁殖而成的琼脂斜面菌种称为一级菌种。用一级种在木屑、粪草等天然固体培养料上扩大繁殖而成的瓶(袋)装菌种称为二级菌种。用二级种扩大繁殖而成的直接用作栽培基质的菌种体的菌种称为三级菌种。由于历史原因，在我国不少地方，习惯于将以上一、二、三级菌种分别称为“母种”、“原种”、“栽培种”。与上述习惯称谓不同，在中国食用菌栽培学(1988)等著作中，将上述一、二、三级菌种分别称为“原种”、“母种”及“栽培种”。(二)、固体菌种与液体菌种在菌种制作及栽培过程中都离不开各种各样的培养基。培养基是人工配制的适合菌体生长繁殖的营养基质。按照培养基制成后的物理状态，可将其分为液体培养基和固体培养基。罐的清洗斜面种子培养基空气

一级种子空气压缩机

空罐灭菌二级种子灭菌除水器

滤菌器无菌水洗无菌空罐发酵过程监测发酵无菌空气放罐图5-2食用菌深层发酵的工艺流程

液体培养基是将营养成分加适量水配制成的培养基。液体培养基加一定量的凝固剂便成为固体培养基。在一级种生产过程中，在液体培养基中加入2％的琼脂做凝固剂制得的培养基即是一种常用的固体培养基。除了加凝固剂的固体培养基外，一些天然固体基质制成的培养基，通常也称为固体培养基。例如培养香菇菌种用的木屑培养基就是这种类型的固体培养基。

用固体培养基和液体培养基制得的菌种相应地分别称之为固体菌种和液体菌种。中国是产量位居世界第一的蕈菌生产大国，每年所需菌种及制作菌种的原料的数量都十分庞大。固体菌种具有原料廉价易得、生产规模可灵活调整、菌丝体生产健壮、便于用户对菌种质量进行目测、贮存及长途运输均较为方便等优点，同时，各级菌种生产单位在长期实践中，在固体菌种制作过程中的质量控制及生产管理方面已积累了较丰富的经验。

因此，迄今为止，中国常见栽培蕈菌所使用的菌种基本上都是固体菌种。(三)菌种的种型1．木屑种指以含木质素、纤维素较多的木屑为主要原料制作的菌种2．粪草种指以发酵或不发酵的粪草为主要原料生产的苗种。3．谷粒种指用大麦、小麦和黑麦等谷类作物籽粒作培养基生产的菌种。4．木块种指用圆形、锲形等形状的小木块为培养基制作的菌种，这种种型的菌种通常仅用于香菇、木耳等木腐菌的段木栽培。5．颗粒种指以木屑、秸秆、堆肥等适宜材料用人工工艺制成颗粒型基质后生产的菌种。近些年来颗粒种的生产工艺正日益完善，虽然目前尚未成为—种主要的种型，但具有较广阔的发展前景。第四节培养基微生物在生长发育过程中，时刻都离不开吸收和利用各种必需的养料。培养基就是人工配制的适于某种菌类生长发育或代谢产物积累的营养基质。营养生理特性不同的菌类，对培养基的要求也有所不同。只有根据培养对象的特性配制相应的培养基，才能充分满足其生长发育的需要。

同时，在菌种分离纯化、接种培养的各个环节中，都经常面临着杂菌侵染的威胁。因此，对培养基、接种工具、接种场所、培养场所等进行有效的灭菌或消毒十分重要。总之，配制营养丰富、养分平衡，适合菌类生长发育的培养基，正确掌握并合理应用消毒灭菌技术，都是菌种生产得以顺利进行的不可缺少的条件。一、培养基的种类和配制原则（一）培养基的营养成分像培养其他微生物的培养基一样，蕈菌培养基中也含有维持其生长发育所必需的碳源、氮源、矿质元素、生长因素等营养成分。不过在对各种不同营养物质需要的数量和所能利用的程度上，蕈菌有自己的特性。1、碳源碳源是蕈菌最重要的营养来源，它不仅是蕈菌合成菌体细胞必不可少的原料，而且是其生命活动的能量来源。蕈菌不能利用单质碳及二氧化碳、碳酸盐等无机碳，而只能利用纤维素、半纤维素、淀粉、寡糖、单糖、果胶、有机酸、醇类等有机碳化物。在常见碳源中，单糖、低分子的有机酸、醇等可直接利用，而纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶等大分子化合物则必须经相应的酶分解为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、果糖等简单糖类后，才能被吸收利用。在蕈菌制种及栽培中，除有时直接用少量葡萄糖、蔗糖等简单糖类外，碳源主要来自各种富含淀粉，纤维素，半纤维素、木质素的植物性原料及农、林副产晶，如马铃薯、秸秆、木屑、甘蔗渣等。

2、氮源氮源是合成蛋白质及核酸的重要原料。蕈菌不能直接利用氮气。蛋白质、氨基酸、尿素等有机氮化物是蕈菌的良好氮源，但蛋白质这类高分子合氮化合物，需经蛋白酶分解为氨基酸后方可利用。蕈菌也可利用氨、铵盐等无机氮，但对硝酸盐的利用通常较差，有些菇类如双孢蘑菇甚至完全不能利用。

对食用菌（蕈菌）而言，完全用无机氮作氮源是不适当的。由于蕈菌细胞不具备合成自身所必需的全部氨基酸的能力，某些必需氨基酸几乎或完全不能由无机氮合成；有的即使能够合成，也不能满足菇类生长发育所必需的量。因此对蕈菌而言，完全用无机氮作氮源是不适当的。

不仅不同食用菌（蕈菌）对氮源的需要量可能有所不同，而且同一种蕈菌在营养生长(菌丝体阶段)及生殖生长(子实体阶段)所需氮量也不相同。一般食用菌（蕈菌）菌丝体阶段对氮素的需要量高于子实体阶段，在子实体阶段，基质中氮素含量过高，反而有碍子实体发育。碳、氮两种元素的比例(C/N)要恰当为了使食用菌（蕈菌）能正常生长发育，培养基中除必须有充足的碳、氮营养外，碳、氮两种元素的比例(C/N)也要恰当。例如，草菇营养生长阶段适宜碳氮比约20：1,而生殖生长阶段约为30-40：1。双孢蘑菇堆肥的初始碳氮比以30-33：1为好。有利于于实体分化发育的碳氮比约为17：1。3.矿质元素蕈菌在生长发育过程中需要一定的矿质营养。其中，磷、钾、硫、钙、镁等“大量元素”的需要量较多，一般通过加入适量磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钙(石膏)、硫酸镁等无机盐予以提供；而铁、钴、锰、锌，硼筹“微量元素”的需要量甚微，由于自来水及作为培养基原料的农副产品中通常含有足量的微量元素，一般不必另行添加。4.生长因素（维生素类物质）食用菌（蕈菌）生长发育过程中，还需要一些维生素、核酸、生长激素等具有特殊生理活性的复杂有机物。这类被称作“生长因素”的物质，虽需量甚微，但如果缺乏，会对蕈菌正常生长发育产生严重影响。请注意“生长因素”与“生物因素”的区别：双孢蘑菇、银耳等食用菌（蕈菌）生长发育过程中，还需要某些/某种“生物因素”（微生物）。

食用菌（蕈菌）所需的生长因素，以属于B族维生素的硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)以及吡哆醇(维生素B6的一种)以及生物素(维生素H)等较为重要。一般而言，蕈菌所需生长因素在马铃薯、酵母、麦芽、麦麸、米糠等植物性原料中含量比较丰富，配制培养基时通常不必另行添加。(二)培养基的种类为了适应不同微生物或不同研究目的的需要，人们发明、研制了多种多样的培养基。不过，虽然不同配方的培养基为数众多，但依据其成分、形态或用途，我们可以将数以百计的培养基归结为几种特定的类型。1、按照对于培养基的组成物质的化学成分是否完全了解，可将培养基分为合成培养基与天然培养基。

合成培养基是用化学成分完全了解的物质制成的，如微生物实验室中常用于培养一般真菌的查氏培养基就是一种合成培养基。合成培养基成分精确，试验结果的重复性强，但价格昂贵，且菌类在这种培养基上生长缓慢。所以一般只适于在实验室范围内做有关营养、代谢，菌种鉴定等工作时应用。

天然培养基是指用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物制成的培养基。由于天然培养基取材方便、价格低廉，所以除实验室经常应用外，更适于在生产上大规模培养菌类时使用。半合成培养基是指在合成培养基中加入某种天然成分配制的培养基。斜面菌种培养中常用的马铃薯葡萄糖培养基（PDA）就是一种半合成培养基。2按照培养基制成后的物理状态，可将其分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。液体培养基广泛应用于微生物的大规模工业化生产以及代谢生理等基础研究。近些年来，虽然国内外对液体培养在蕈菌制种中的应用作过大量研究，进行了一些有益的尝试，但由于存在若干有待解决的问题，至今尚未投入实际应用。

液体培养基加一定量凝固剂便成为固定培养基。比较理想的凝固剂应具备如下条件：不被微生物液化、分解和利用在菌类生长的温度范围内保持固体状态凝固点的温度对菌类无害不因灭菌而被破坏，失去凝固性配制方便，价格低廉透明度好，粘着力强与微生物实验室中也有应用的明胶、硅胶等凝固剂相比，琼脂是最符合上述条件的凝固剂。在蕈菌斜面菌种生产中，通常都用琼脂作凝固剂。

除了加凝固剂的固体培养基以外，一些天然固体基质制成的培养基，通常也称为固体培养基，例如，培养香菇菌种的木屑培养基，培养双孢蘑菇菌种的麦粒培养基都属于这种类型的固体培养基。半固体培养基：含较少量琼脂(0.1%～0.5%)的培养基称为半固体培养基。半固体培养基在细菌运动观察一类研究中应用较多。在蜜环菌（天麻的伴生菌）菌种制作中也常用半固体培养基。3、按照培养基的用途，可将培养基分为：基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择性培养基等。

基础培养基是指合某一类微生物所需基本营养成分的培养基，它常常作为其他特殊用途培养基的基础成分，如PDA。

加富培养基是指加有某些动、植物组织提取液等高营养成分的培养基，常用于培养某些营养需求比较特殊的微生物，也常用于富集混合的微生物群体中的某一种微生物，如PDA+VB1。

鉴别培养基在培养基中加入某种试剂或化学药品，使不同微生物产生不同的反应，借以将它们区别开来，这样的培养基叫做鉴别培养基。总的说来，在常规菌种生产中，与普通制种用培养基相比，上述三类特殊用途培养基的应用较少，其中，鉴别培养基尤为少用。。鉴别培养基

麦芽提取物25g牛肉膏5g25℃、21天每7天查一次，退色的琼脂20g为白腐不退色的褐腐纯净水1000mL（白腐菌、褐腐菌鉴别培养基）加入0.007%龙胆紫由于某些担子菌的活动，木材纤维素、木质素因酶均被降解，导致木材的白色海绵状外貌，如松栓菌导致白腐。由于某些担子菌的活动，纤维素被降解,而褐色木质素保留，木材易粉碎。如香菇、茯苓导致褐腐褐腐白腐

选择性培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求，或对物理、化学因素的抗性而设计的对特定对象具有选择作用的培养基，如PDA+青霉素。选择性培养基在菌种分离、纯化等工作中应用较多。例如，青霉素、链霉素等抗菌素对细菌有抑制作用，但对食用菌的生长发育并无妨碍。因此，在单孢分离或进行某些研究工作时，可加入青霉素、链霉素等抗菌素制成选择性培养基，以排除细菌污染对工作的干扰。（三）配制培养基的原则要根据不同菇类的营养需要配制相应的培养基各种营养物质要有适宜的浓度和配比要使培养基能保持适宜的酸碱度根据不同的培养目的选用相应的培养基此外，配制用于苗种生产或栽培的培养基，由于用量大，所用原料除应能满足菌类生长发育的需要外，还必须价廉易得，以便降低成本，提高经济效益。二、制种用培养基的制作总的说来，就一级菌种所用的琼脂斜面培养基的制作而言，蕈菌中所采用的方法与其他微生物中所采用的方法是基本相同的。但是，在其后的扩大培养中，蕈菌菌种生产采用固体培养方式，而微生物工业发酵则采用液体培养途径。生产方式的不同，导致培养基制作的技术和方法也不相同。下面将着重讨论菌种生产中二、三级种培养基即母种、栽培种培养基制作中值得注意的一些问题。（一）常用培养基的配方在菌种的分离纯化、扩大繁殖及杂菌鉴定等工作中，需使用多种多样成分、用途各不相同的培养基。（二）原料的选择母种、栽培种培养基多以植物性的农、林、副产品为主要原料。在原料的选择上应注意如下几点；

1、原料要新鲜、干燥

陈旧、潮湿的原料不仅容易滋生杂菌、螨类等有害生物，而且某些养分的含量也大为减少。例如，新鲜米糠含有大量维生素B1和烟酸，但陈旧的米糠中烟酸几乎不再存在。新鲜米糠含有相当数量的粗脂肪，在高温。高湿条件下，存放一个月之后，即可分解，损失60%以上因此，除木屑有时可选用较陈旧的(如用于金针菇制种)之外，要力求选用新鲜、干燥的原料。

2、原料的质量要符合要求随着加工方式及程度的不同，所得米糠及麦麸的质量也不尽相同。米糠要用细糠，三七糠、统糠所含养分不足，不宜供配制培养基之用。麦麸有所谓红、白麦麸之分，宜选用营养成分较丰富的红麦麸。

3、原料的质地、粒径要适宜原料的质地及颗粒的粗细对培养基的质量也有较大影响，应根据实际情况合理选用。例如，在用粪草培养基培养蘑菇菌种时，宜用质地较软的大麦草。如用质地坚硬、不易软化、折断的小麦草，菌丝长势较差。分解力较强的香菇、木耳，制种时可选用硬质杂木屑，分解力较弱的饵耳，制种时宜选用易分解的软质阔叶树木屑。木屑的颗粒不宜过细，以免通气不良，影响菌丝生长。粪草培养基中，草料不宜过长，一般以切成3cm长的短草为宜。4、原料中应不含有害物质松、杉，柏等针叶树及樟树、楠树等阔叶树木屑含有芳香油、醚等杀菌物质，不宜使用。含有过多机油的木屑有碍菌丝生长，应予剔除。（三）拌料与分装1、分类处理，搅拌均匀2、控制水量，务求适宜3、松紧适宜，装量适度(四)培养基的灭菌1、迅速装料灭菌，减少杂菌自繁2、分层放置，均匀透气3、旺火升温。高温足时4、小心搬运，减少破损小结：培养基的类型及应用

(一)、按培养基的物理状态分液体培养基、固化培养基和固体培养基(二)、按营养物质的成分；可分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基(三)、根据培养基的主料，可分为马铃薯培养基、玉米粉培养基、胡萝卜培养基、果汁培养基、棉籽壳培养基、麦粒培养基、木屑培养基、木块培养基、粪草培养基等。几个容易混淆的概念1.灭菌

：采用物理或化学的方法，彻底杀灭一定范围内的物料及其容器中的一切微生物的过程，叫做灭菌。2.消毒：采用物理或化学的方法，消灭物体表面或环境中一部分微生物（有害微生物）的过程，叫做消毒。消毒也称简易非彻底的灭菌。在医学上泛指对病原微生物的杀灭。3.杀菌：用物理或化学的方法杀死一定范围内（例如罐头中）的致病菌、产毒菌的过程，叫做杀菌。4.防腐：采取一定的措施，使处理对象保存更长的时间的过程，叫做防腐。

三、灭菌方法：

(一)、常用的灭菌方法有物理灭菌和化学灭菌两大类。

1、物理灭菌：指用高热、辐射、过滤等物理手灭除微生物的方法。在食用菌科学研究和生产中，对培养基、工作衣等常用高压蒸气灭菌；金属接种工具采用灼烧灭菌；玻璃器皿采用干热灭菌。而对一些不耐温、体积庞大的培养基和物品，常采用射线和紫外线等辐射灭菌。对热不稳定的生化药品如酶制剂、维生素的水溶液等，则采用过滤除菌。

2、化学灭菌：是采用酸、碱、酚、醇、重金属、氧化还原剂、表面活性剂、染化学药品，器皿进行浸泡灭菌对空间进行熏蒸灭菌。

(二)、培养基灭菌法：用热力或其他方法，使培养基达到无菌状态的方法。经过灭菌的培养基，要求养分不受破坏，并彻底灭菌。这就要根据其物理形态、容器和设备的不同，选用相应的方法灭菌。

根据培养基的物理形态、容器和设备的不同，选用相应的方法灭菌。

1、固体培养基：可采用高压蒸汽或常压蒸汽灭菌。2、固化培养基：应采用高压蒸汽灭菌。3、液体培养基：瓶装液体培养基的灭菌方法与固化类型培养基相同；发酵罐的液体培养基是采用通高压蒸汽在罐内直接灭菌；含热不稳定物质的液体培养基，可采用过滤除菌法。（三）消毒剂：具有杀菌能力的化学药物叫做消毒剂，亦称杀菌剂。食用菌生产中常用的消毒剂如下：乙醇(酒精)常用浓度：70％

福尔马林(40％的甲醛水溶液)苯酚(石炭酸)5％

煤酚皂溶液(来苏尔)1％～3％

新洁尔灭0.25％

波尔多液漂白粉(次氯酸钙)2％～5％

消毒剂一般只对细菌的繁殖体有效，而对于芽孢很少有杀死作用。硫磺高锰酸钾0.1％过氧化氢(双氧水）过氧乙酸(过氧醋酸)0.2％～0.5％（喷雾），5ml/m³（熏蒸）

常用消毒剂使用方法消毒剂名称用途用量和使用方法注意事项甲醛溶液（HCHO）Formalin空间或表面消毒熏蒸8～10ml/m3喷雾2%溶液1．有白色沉淀时加几滴硫酸溶解2．注意皮肤和眼睛的防护3．先用来苏尔溶液空间喷雾再用甲醛熏蒸效果更好硫磺（S）sulphur空间消毒15～20g/m3燃烧熏蒸1．消毒空间时先喷水预湿2．金属用具易锈蚀应防护酒精（C2H5OH）Alcohol手及器皿表面消毒70%~75%易燃，注意按实验室操作方法使用高锰酸钾（KMnO4）potassiumpermanganate1．甲醛熏蒸助蒸剂2．用品器具表面消毒1．5ml/m32．0.1%~0.2%水溶液随用随取随配来苏尔（C6H4CH3OH）lysol手和器皿表面消毒，空间喷雾1．浸泡容器用3%水溶液时间1h2．洗手和空间喷雾用2%水溶液亦称煤酚皂新洁尔灭（C22H40BrN）Bromo-geraminum皮肤和不耐热的器皿表面消毒0.1%~0.25%水溶液亦称苯扎溴铵，系阳离子表面活性剂。避免与阴离子表面活性剂（如肥皂、合成洗涤剂等）合用洗必泰（C12H30Cl2N10）chlorhexidin皮肤和不耐热的器皿表面消毒0.5%~1.0%水溶液亦称氯已定，系阳离子表面活性剂。避免与阴离子表面活性剂（如肥皂、合成洗涤剂等）合用石碳酸（C6H5OH）phenol空间和表面消毒5%水溶液亦称苯酚，对皮肤有腐蚀作用过氧乙酸（CH3COOOH）PeraceticAcid1．手和器械表面消毒2．空间消毒（优于甲醛）1．表面消毒0.2%~0.5的水溶液浸洗2．空间消毒，先用0.5%水溶液喷雾增湿，再用20%药液5ml/m3熏蒸1．勿与碱性药品混合2．其它注意事项，详见产品说明书烟雾消毒剂smogdisinfeltor（含氯量>48%）空间消毒3～4g/m3，燃烧熏蒸1.消毒空间先喷水预湿2.用火星点燃本品，密闭20分钟即可3.本品应贮存于阴凉干燥处，慎防水火侵袭漂白粉Chlorioleoflime在水溶液中放出有效氯，破坏细菌酶的活性而致死亡。能杀灭各种致病菌病毒芽胞1%－3%澄清液喷洒（100－300ml/m3）消毒30min后通风；0.5%~1%的漂白粉溶液能在1~5分钟内杀死大部分