不同含水量刺槐种子萌发特性及生理生化指标测定

不同含水量刺槐种子萌发特性及生理生化指标测定

种子超干贮藏是指种子含水量降至5%以下，种子在密封条件下或稍冷下保存的一种方法。常用于种质资源和高价值种子的长期保存。传统的低温贮藏的建库投资和操作运转费用相当高,对发展中国家是一个较大的负担,而超干种子贮藏简便易行、经济实用,应用前景广泛。1985年,国际植物资源委员会首先提出对某些作物种子采用超干贮存的设想,1986年,英国里丁大学首先开始超干种子研究。郑光华等在我国开展超干种子贮藏研究,20多年来,对多数农作物种子的超干保存技术研究取得了很大的成果,但是对于林木种子的超干储存研究仅限于马尾松、杉木、西南桦等。对种源不同的林木种子超干贮藏特性未见报道。刺槐是干旱半干旱地区的主要造林树种,本试验首次研究超干及其老化处理对刺槐种子的活力和生理生化特性,获得刺槐种子超干储藏特性及其生理生化变化规律,为干旱半干旱地区植被恢复提供依据,为刺槐种子种质资源的保存和其它林木种子的相关研究和贮藏提供参考。1材料和方法1.1仿真试验和贮藏试验刺槐种子于2007年秋采自陕西省延安市和陕西省吴起县,原始含水率分别为6.9%和7.4%,千粒重分别为(18.53±0.34)g和(16.62±0.48)g,采种量各5kg,试验前,种子置于敞口的布袋中,贮存在通风的室内(温度15～18℃,相对湿度35%～45%)。1.2方法1.2.1特征胶的制备种子置于纱布袋中,放在下层为硅胶的干燥器中。硅胶与种子质量比为10∶1,每天更换经120℃烘干冷却至室温的干硅胶。每5d定时称重,制备不同含水量的超干种子。超干种子密封于具塞试管中。1.2.2超干种子的干燥处理种子密封于具塞试管中,置于50℃生化培养箱中老化30d。1.2.3水处理系统不同温度对cacl2和nacl2的耐水处理样品处理超干处理和超干老化处理的种子,测定指标前,先将种子置于底部盛有饱和CaCl2溶液的干燥器中(相对湿度35%),室温(15～18℃)回水处理2d,然后转移至盛有饱和NaCl溶液的干燥器中(相对湿度75%),室温回水处理2d后,取出至室温放置。1.2.4发芽试验试验按《林木种子检验规程》GB2722-1999的技术标准进行。4个重复,每个重复100粒种子,种子经85℃温水自然冷却浸泡24h,未吸胀种子划破种皮,用去离子水充分冲洗干净,置于铺有3层滤纸的培养皿中,置于25℃培养箱进行发芽试验14d统计发芽率。1.2.5浸泡时间对电导率的影响取50粒种子称重,用去离子水冲洗数次,吸干表面水分,置带盖的器皿中,加100ml去离子水,于28℃浸泡2,4,6,8,10h,用电导仪(delta326,上海制造)测定浸泡液电导率(Ci,i=2,4,6,8,10)然后加热煮沸10min冷却至28℃测定电导率(C0)。重复3次。相对电导率按照以下公式计算:相对电导率(%)=100Ci/C0。1.2.6ttf值的测定TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)法,刺槐种子每样20粒称重,3个重复,划破种皮,45℃温水室内自然冷却浸种24h(室温15～18℃),剥掉种皮,加10ml0.1%TTC溶液(现用现配),放在38℃的恒温水浴中(加盖保持黑暗条件)染色4h,用双蒸水冲洗2～3次,以粗滤纸吸去浮水,加少许分析纯石英砂及丙酮研磨,将研磨液倒入10ml的容量瓶中定容,将提取液和残渣3000r/min下离心10min,上清液在波长490nm处测定密度值,根据标准曲线得出还原态TTC值。1.2.7紫外分光光密度测定取刺槐种子每样20粒,3个重复,划破种皮,45℃温水室内自然冷却浸种24h,剥掉种皮,加入少量分析纯石英砂和5ml研磨缓冲液研磨冲洗,转移到试管中,将提取液放在70℃恒温中加热20min,一层纱布过滤后4000r/min离心5min,倾出上清液,用研磨缓冲液定容至10ml作为酶制剂,吸取1ml酶制剂放入试管中,加入1ml淀粉溶液和1ml反应缓冲液,摇匀放在37℃的恒温水浴中保温,经过0、5、10min,分别吸取0.3ml的反应混合液放入试管中,迅速加入1ml显色剂,加入3ml蒸馏水,充分摇匀,用TU-1801紫外可见分光光度计在620nm的波长下测定其光密度值,得到OD620(0)、OD620(5)、OD620(10),计算5min和10min的光密度变化值ΔOD620(5)和ΔOD620(10)。淀粉酶[mg/(粒·min)]=ΔOD620(t)av/v1OD620(0)twmin)]=ΔΟD620(t)av/v1ΟD620(0)twOD620(0)为0min的光密度值,ΔOD620(t)为时间t的光密度变化值,t为反应时间,a为每次试验样品混合液中含淀粉毫克数(0.3ml混合液含有0.1ml淀粉溶液,含淀粉0.1mg),v为提取的酶制剂总体积(10ml),w为种子粒数,v1为每次测定用酶制剂体积(0.3ml混合液含有0.1ml酶制剂)。1.3数据分析方差分析与多重比较应用SPSS11.5软件辅助完成。试验于2007年11月～2008年3月在国家林业局北方林木种子检验中心完成。2结果与分析2.1种子含水量对发芽率的影响吴起种源刺槐种子的干燥速率快于延安种源刺槐种子(图1),刺槐种子初始含水量延安种源低于吴起种源,千粒重高于吴起种源,发芽率低于吴起种源,刺槐种子均为当年同期采种,同一自然条件下干燥,原因可能为延安种源刺槐种子完成后熟的效果弱于吴起种源,在浸种发芽过程中,浸种后的刺槐种子硬粒数吴起种源多于延安种源。延安种源刺槐种子超干燥后回湿处理,种子发芽率均低于自然干燥含水量种子(含水量6.9%),种子含水量降至4.2%时,发芽率降幅较大。吴起种源刺槐种子超干后回湿,当含水量不低于4.3%时,种子发芽率比自然干燥种子(含水量7.4%)有一定程度的提高(表1),这与湿干交替处理有利于种子活化,种子内部生理过程受到促进,加速种子发芽有关。干燥种子50℃老化30d后,经回湿处理,发芽率表现出显著性差异(表1),说明含水量对种子抗老化的能力影响显著。老化后,延安种源含水量4.8%的种子和吴起种源为含水量4.3%的种子发芽率最高,说明后熟度对种子耐超干燥的能力有较显著的影响。2.2膜的选择透性与种子劣变的关系膜系统在细胞的各种生理及生化作用上,起着无比重要的作用。当种子发生劣变时,细胞膜受到损伤,透性增大,在浸出液中会析出较多的电解质,因而测得的电导率较高。对于同一树种,种子自身存在着较大差异。相对电导率在比较各品种之间电导率差异时采用较多,最近一些种子保存特性的研究也采用相对电导率,一方面避免所选种子自身差异造成对观测效果的混淆,一方面能够直观地描述细胞膜的选择透性在种子劣变过程中的变化。延安种源刺槐种子超干燥后回湿,当含水量不低于4.8%时,相对电导率无显著变化(图2),含水量降至4.2%时,相对电导率显著增加,细胞膜的选择透性最差,超干后回湿措施没有对细胞膜产生显著修复。吴起种源刺槐种子含水量不低于4.3%时,超干燥后回湿种子相对电导率无显著性变化(图4),当含水量降至3.8%时,种子相对电导率显著性升高,则细胞膜的选择透性最差。老化30d后,种子相对含水量均高于老化前的含水量,种子均发生一定程度的劣变。延安种源含水量4.8%的种子相对电导率最低,细胞膜具有相对较好的选择透性(图3)。吴起种源超干燥刺槐种子的相对电导率均低于含水量7.4%的种子,超干燥种子细胞膜选择透性较好(图5)。超干后和老化后种子的相对电导率,延安种源均明显高于吴起种源,吴起种源种子的细胞膜选择透性好于延安种源,这与吴起种源刺槐种子后熟度高,硬实率高有关,研究表明硬实的种子,对成熟期间和贮藏期间不良条件的抵抗能力较强,易于保持较高活力。2.3种子含水率对刺槐种子脱氢酶活性的影响种子脱氢酶活性与种子活力关系密切,是种子生活力和活力的最重要生理指标之一,可反应细胞代谢的还原能力和胚损伤程度。脱氢酶活性测定采用TTC定量法,是对种子染色的定量分析。超干燥处理回湿后,延安种源刺槐种子脱氢酶活性自然干燥含水量最高,当含水量不低于4.3%时,吴起种源超干燥刺槐种子脱氢酶活性均高于自然干燥含水量种子,这与湿干交替促进种子活力有关。当种子含水量降至3.8%时,刺槐种子脱氢酶活性显著性低于自然干燥含水量种子。因此,刺槐种子脱氢酶活性受含水量影响较大,种子耐干燥的能力有一定的限制,从延安种源和吴起种源刺槐种子脱氢酶变化来看,不同种源地对刺槐脱氢酶活性变化也有显著影响。超干燥种子50℃老化30d后,经回湿处理,脱氢酶表现出显著性差异(表2)。一定超干燥含水量范围内(延安种源>4.8%,吴起种源>4.3%),种子脱氢酶活性均高于自然干燥含水量种子。延安种源含水量为4.8%刺槐种子脱氢酶活性最高,吴起种源含水量为4.3%刺槐种子脱氢酶活性最高。对于延安种源刺槐种子,种质相对较差,尽管具有一定耐超干燥的能力,超干后回湿的发芽率低于自然含水量种子。种质较好的吴起种源刺槐种子超干燥后回湿种子活力提高,且具有较强的抗老化能力,适合超干燥保存。2.4种子抗氧化能力的变化当种子萌发时,淀粉为淀粉酶所分解。α-淀粉酶是在发芽过程中形成的,其活性随萌发时间的延长而增高,种子萌发过程中,α-淀粉酶可将淀粉分解为糊精和麦芽糖,从另一个侧面反映了种子活力。5min内试验结果表明:延安种源刺槐种子自然干燥含水量种子α-淀粉酶活性高于超干燥含水量种子,当含水量不低于4.3%时,吴起种源刺槐种子α-淀粉酶活性高于自然干燥含水量种子,当含水量低于3.8%时,α-淀粉酶活性低于自然干燥含水量的种子。10min内α-淀粉酶活性表现出与5min内相一致的规律(表2)。超干燥种子50℃老化30d后,经回湿处理,α-淀粉酶活性表现出显著性差异(表2)。延安种源含水量为4.8%刺槐种子5min和10min内α-淀粉酶活性均最高,吴起种源含水量为4.3%刺槐种子α-淀粉酶活性最高。延安种源刺槐种子尽管一定超干燥含水量范围(含水量>4.8%)内,种子抗老化能力较强,但是超干后回湿种子α-淀粉酶活性均低于自然干燥种子。吴起种源刺槐种子当含水量不低于4.3%时,超干后回湿和老化30d后,α-淀粉酶活性均高于自然干燥含水量种子,适合超干燥保存。3种子超干燥贮藏(1)种子超干燥贮藏是种子界研究的热点,试验已证明,许多种子都可进行超干燥贮藏,但不同类型的种子耐干程度差异较大,同一种子的不同品种间的研究在农作物中已有报道,种源地和种质对种子耐干性的研究尚未见报道,对延安种源和吴起种源的刺槐种子的研究表明,种源地对于种子的耐超干性具有一定的作用。因此,在种子的超干燥贮藏过程中,在依据某一种子超干燥研究成果的同时,要充分考虑所贮藏种子的种质。(2)本试验采用硅胶室温干燥法获得超干燥种子,对刺槐的超干燥过程比较缓慢。有研究表明,干燥速率对种子活力也有一定程度的影响。人工老化的方法证明,刺槐种子超干燥贮藏的优越性的同时,尚需实际贮藏验证。4种子贮藏稳定性(1)刺槐种子超干后回湿处理,延安种源刺槐种子含水量不低于4.8%时,种子发芽率、