大鼠肝细胞低氧预处理后蛋白质分子的二维电泳实验研究

1、大鼠肝细胞低氧预处置惩罚后卵白质分子的二维电泳实行研究【摘要】目的利用二维电泳技能对大鼠肝细胞卵白举行分散，以进一步探究低氧预处置惩罚庇护肝细胞的机制。要领将原代造就的肝细胞分成比拟组和低氧预处置惩罚组，用固相化ph梯度等电聚焦的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技能展示并比力两组细胞表达的全部卵白质，银染法表现两组细胞差异表达的卵白质分子。结果两组肝细胞的卵白质图谱别离可区分出约260个卵白点，绝大多数卵白点在位置、巨细和外形上险些同等。比拟组和预处置惩罚组间有11个显着差异的卵白点，开端确定其等电点和分子量。此中5个卵白质点仅在比拟组中表达，而在预处置惩罚组中未出现；6个卵白质点在预处置惩罚组中表达，

2、而在比拟组中未出现。结论二维电泳可以对肝细胞卵白举行较准确的分散；低氧预处置惩罚引起肝细胞卵白质分子的改变，在预处置惩罚组中新增长的卵白质分子大概与细胞耐受低氧有关。【关键词】肝细胞；低氧预处置惩罚；二维卵白电泳；大鼠experientalstudynrathepatytesprteinsafterhypxiprenditiningbyt-diensinalgeleletrphresishenei，uzhiyng，sunyngei，etal.departentfgeneralsurgery，renjihspital，shanghaijiatnguniversity，shlfediine，sha

3、nghai200127keyrdshepatyte；hypxiprenditining；t-diensinalgeleletrphresis；rats低氧预处置惩罚能进步肝细胞对低氧的耐受性，减轻再灌氧损伤，然而，我们仍不明晰低氧预处置惩罚后肝细胞内种种细胞因子的变革1。我们利用基因芯片技能研究低氧预处置惩罚后肝细胞基因表达谱的变革，创造低氧预处置惩罚对肝细胞的庇护作用大概通过多个途径来实现2。因此，我们运用卵白组阐发技能，以得到正常肝细胞和低氧预处置惩罚后肝细胞的卵白电泳图谱，并加以阐发，以创造与低氧预处置惩罚相干的卵白质分子，为以后从卵白质程度上进一步研究低氧预处置惩罚庇护肝细胞的机制打下

4、基矗1质料与要领1.1实行质料粗制iv型胶原酶、碘代乙酰胺和teed美国siga公司；95%n2-5%2混淆气体和95%2-5%2混淆气体上海比欧西气体公司；尿素、甘氨酸和二硫苏糖醇dtt美国bibasi公司；haps、pharalyte3-10、ipg缓冲液，覆盖油和预制ipg胶条ph310，线性瑞典aershapharaia公司；tris、十二烷基磺酸钠sds和过硫酸铵美国ares公司；二维电泳卵白尺度品美国bi-rad公司。queue2711三气造就箱美国parkersburg公司；ultiphriieletrphresissyste瑞典aershapharaia公司；prteantii

5、垂直电泳槽和pdquestt2-d图像阐发软件美国bi-rad公司。雄性sprague-daley大鼠10只，由中国科学院上海实行动物中央提供，质量为200250g，尺度条件豢养。2.1实行要领将ipg胶条ph310，线性，13置于水化槽，取上述两种卵白质样品各100g，别离参加水化液8尿素、2%haps、1%dtt和0.002%溴酚兰，去离子水配制至终体积达250l，混匀后加到槽内水化ipg胶条，并留宿。ipg胶条完全水化后，在如下条件中举行一维等电聚焦分散：第一步500v，1h；第二步3500v，7h，总聚焦时间25000vh。每一块银染后的凝胶经透射式激光扫描仪600bpi区分率扫描后，

6、所得图谱借助2-d图像阐发软件pdquest7.0阐发卵白质二维电泳图谱，举行卵白质斑点检测和配比，寻出差异显着的卵白点，并把这些差异表达的卵白质分为2类：a类，预处置惩罚组肝细胞中表达而比拟组中无表达；b类，比拟组肝细胞中表达而预处置惩罚中无表达。按照尺度卵白质分子指示的位置及线性ph梯度，测出差异卵白质的等电点和分子量。3结果3.1细胞分散和造就肝细胞均匀得率为1.60.3108/肝，活力93.632.7%，纯度95%以上。3.2二维卵白电泳的区分率和重复性每种样品的二维电泳重复4次，在预处置惩罚组和比拟组中各拔取4张卵白图谱，应用pdquest软件举行图像阐发，别离可区分出约260个卵白

7、点，即可区分出同样数目种类的卵白质见图1和图2。图1a拔取的是预处置惩罚组肝细胞卵白的电泳扫描图，图1b为重复举行的电泳扫描图。结果表白，同种卵白样品经重复举行的电泳扫描图谱卵白斑点匹配率约为95%，绝大部门卵白都能较好地重叠，重复性较好，区分率较高。3.3比拟组和预处置惩罚组肝细胞卵白质的二维电泳图谱比力图2和图3为本实行创立的具有代表性的比拟组和预处置惩罚组肝细胞卵白二维电泳图。图2为参考图谱，图3卵白斑点与之比力，按照斑点的位置、大孝外形等参数，图像阐发软件主动将差异图谱中的雷同卵白点匹配，不克不及匹配的差异点可主动标出。检测表现，两组肝细胞的卵白质图谱中绝大多数卵白点在位置、巨细和外形

8、上险些同等。通过比力，我们创造了11个有显着差异的卵白点(见表1)。4讨论二维卵白电泳技能是当前分散构造、细胞卵白最有用的分散本领。卵白质组研究的重要本领是二维卵白电泳、盘算机图像阐发和卵白质断定技能。二维电泳是条件，其分散结果直接影响图像阐发和断定。在处置惩罚样品时应该只管想法使样品中全部的卵白溶解，为了得到高区分率，还必须参加复原剂如dtt来复原全部的二硫键，大概参加尿素使卵白质复合物完全变为多肽链4。本实行接纳瑞典aershapharaia公司的ultiphrii电泳体系和ipg胶条举行等电聚焦，将样品直接参加水化溶液，一方面节流了水化溶液，进步样品溶解性；另一方面制止了样品杯的利用，从

9、而制止在胶面某一点加样所致卵白质沉淀产生，简化操纵步伐，进步样品量、区分率和重复性，得到较好的图像结果。在低氧预处置惩罚庇护肝细胞或缺血预处置惩罚庇护肝脏机制研究中，如今还重要停顿在基因程度，在卵白程度上少见。本实行中，我们接纳ph310宽ph范畴二维电泳对大鼠肝细胞的全卵白质举行等电聚焦，sds凝胶面积为130(160，厚度为1，所分散的卵白斑点为260个摆布，通过对正常肝细胞和预处置惩罚后肝细胞的卵白电泳图谱举行阐发，寻出有显着差异的卵白质点。低氧预处置惩罚或缺血预处置惩罚的庇护机制非常庞大，大概和细胞内一氧化氮合成酶nitrixidesynthase，ns程度进步，合成大量n有关5-6；

10、也大概和种种卵白激酶prteinkinase，pk激活有关，如卵白激酶prteinkinase，pk、核转录因子bnulearfatrkappab，nf-b和丝裂原活化卵白激酶itgen-ativatedprteinkinases，apk等7-9，这些因子都能进步构造器官抗损伤本领。从基因程度挑选抗损伤基因，是当今研究的一个紧张要领，但由于卵白质是细胞生命运动及其成效的重要实行者，差异的卵白质分子负担着差异的成效，因此，直接从卵白质程度比力和挑选与抗损伤相干的卵白质分子具有更紧张代价。原代造就的肝细胞经低氧预处置惩罚后显着耐受恒久低氧造成的损伤，表白细胞内的某些基因或卵白表达升高或低落。我们创

11、造的这11个差异卵白点中，有6个卵白点3，4，5，6，7，10在预处置惩罚组中表达，而比拟组中未出现，提示这些卵白质的表达大概与细胞耐受低氧有关。别的，与比拟组比拟，预处置惩罚组中有5个卵白点1，2，8，9，11未出现，这些消散的卵白质在损伤和抗损伤机制中毕竟起什么作用，有待于进一步研究。通过二维卵白电泳技能，我们得到多个较纯的卵白点，随后可以利用卵白质断定技能，好比质谱技能或定量差异阐发技能来得到每个卵白或多肽的分子量或序列，然后在数据库中举行搜刮10-11，推断出是何种卵白和肽或未知卵白和肽。固然，我们应用此要领并未展示出肝细胞全部卵白质，固然银染要领非常敏捷，但其敏捷度也有必然限度，因此

12、另有很多卵白质未检测出。别的，我们利用了ph310的ipg胶条，而ph3、ph10的卵白质未包罗在内。第二向sds仅展示出分子量畴内的卵白质，而14000，100000的卵白质分子未包罗在内，且在此研究的图谱中有一些卵白质点重叠在一起无法区分，尤其在高分子量区。假设充实显现出肝细胞的卵白质，大概会创造更多有代价的卵白质分子。图1表现了预处置惩罚组肝细胞卵白的2张电泳图谱，说明重要的高品貌卵白斑点的重复性尚可，而其他的低品貌卵白的重复性尚待进步，其大概的缘故原由如下：所选样品的初始状态，样品处置惩罚的重复性，试剂的批号和灌胶匀称与否，直接影响斑点位置的重复性。染色历程中

13、凝胶染色时间的是非和停顿时间是非影响卵白的定量和凝胶中斑点的巨细，对位置变异也有影响。在图像扫描中，所拔取的凝胶的像素影响位置变异。因此急迫必要主动二维电泳仪的出现。本实行创立二维电泳分散肝细胞卵白质的要领，比力比拟组和预处置惩罚组肝细胞卵白质在二维电泳图谱中的差异，为研究这些分子在低氧预处置惩罚防范低氧再灌氧损伤机制中的职位和作用以及它们的布局和成效提供了实行基矗【参考文献】1arinir，grazia，spendrer，etal.isheiprenditiningreduesna+auulatinandellkillinginislatedrathepatytesexpsedthypxia

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