质粒构建ooco

1、引物设计:1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠 倒）。2,在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。1,使用word排除目的片耳里含有的酶斗位R 最后确定中使用的酶2,设计引物：primer-up：保护碱基4个-上游酶切位点 Primer-down：保护碱基，个-下游酶切位点3,核对-送公司合成。4对公司合成的引物离心，10000rpni 5-10分钟、at 4 C,在超净 台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2。，再把上游引物和 下游引物混在一起，at 4 C保存。二，PCR （P出目的片段）：（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里 P出目的片段:1,摇菌过夜：2 2

2、ul韩家淮实验室的菌液，15ml离SXul相应的抗生素 心管-94 C 5min94 C 30secPcr 温度体 R 58c 30SeC 33 33CyCleS 系72 c X minxSJ172 c 5min国ml LB2,pcr:Pcr(50u反系广菌液1ul 2x PFU mix 25ul Primer 1ul2d H2O 23ul（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min,退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2C）3,跑胶、回收：（1）,配胶：1%的琼脂f称0.6g的琼脂糖煮沸3次糖胶：大块 加入60ml的1X TAE J1'I加入0.6ul的EB（待温度降到

3、50-60C左右时）25分钟后，即可点样跑胶。（2）,跑胶：130-150V、25-30 分钟左右。（3）,紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4,做胶回收（天根TIANGEN公司的DNA屯化回收t剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，HutionBuffer预先在55-65 C温箱中水浴，并且在加过 EBB,放在37c温箱中2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立 10ul的体系：回收产物2ul、 10xloading buffer 2ul 、2d H2O 6ul。三，酶切、链接：1,目的片段酶切：（37C酶切过夜或者4小时）insert :上述胶回收产物35ul

4、10 x H buffer (1.5x) 7ul50ul的体系d dd H2O 6ul2,载体酶切:1ul1ul（37C酶切过夜或者4小时）2 ul3ul Vector (1ug/ul):10 x buffer (1.5x)20ul 的体系 d dd H2O 13ul酶 1 1ul二酶 2 1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。3,酶切时，首先要核对一下酶的buffer,有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer,那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物 回收。4,连接：2x Rapid Ligation 6ulVector 0.8ul12ul 的体系 "

5、insert 4.5ul（目的是为了多加点 insert） T4 DNA Lignase 1ul四，转化：感受态细菌10ul 质粒10ul、冰上20分钟-一热激：42 C、90秒-一冰上2分钟、力口 1ml SOC （或者 1mlLB）, 37C、180 rpm、45 分钟。、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨茉）。、250rpm、过夜。五，质粒大抽：六，收菌：取过夜菌至50毫升离心管，离心：6000g、3-5分钟、4C。再重复一次，每管共收集 100毫升过夜菌沉淀。（倒置于草纸上使液体流尽 ）。

6、七， 重悬：每管加入8ml的RES-EF（RnaseA）,重悬细菌沉淀一充分Vortex或用枪头吹打沉淀。 确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3,裂解：每管加入等量的LYS-EF bufffer ,即8ml。轻轻上下颠倒离心管 4-6次，（勿震！ ！）室 温放置5min,使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染4,平衡：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上（或者直接架于50ml离心管架上）：取15ml EQU-EF buffer 沿滤芯四周加入一充分平衡滤芯。注意：离心管内的液体不要浸没滤柱的头，

7、所以要勤于倒弃滤液，在过滤平衡液的同时，进彳T 5、6步，防止滤芯干掉。5,中和：在等待EQU-EF buffer滤完时，往裂解好的菌液中加入 8ml NEU-EF buffer ,颠倒混匀， 冰上孵育5min。（不能vortex）6,离心、过滤：离心中和过的菌液：10000rpm、5-10min、at 4 C-质粒存在于上清中。（离心使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助）：将上清吸入到平衡好的滤芯中，重力自流尽。7,洗一：过滤完毕后，吸取 5ml的FIL-EF buffer,沿滤芯四周加入（将粘在滤芯上的质粒洗下 来）-过滤完后，将滤芯弃掉。8,洗二：往滤柱中加入

8、35ml的ENDO-EF buffer 一去内毒素9,洗三：待滤完后再加入 15ml的wash-EF buffer一过滤。10,洗脱：取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入 5ml日u-EF buffer.（Elu-EF buffer预先放在50c的恒温箱中加热，可提高洗脱效率）11,沉淀：待日u-EF buffer滤完后，弃滤柱，往离心管中加入5ml的异丙醇（将质粒沉淀下来），混匀（充分 vortex）,静止 10min-10000rpm、30min、4 C -弃上清。12,洗涤：加5ml的70%酒精（ETOH或用15ml三蒸水（高压过）+35ml的无水乙醇 配制（在超净台进行），混匀（上下颠倒即可），离心：10000rpm> 10min、常温。 弃上清，