WHO人类精液检验与处理实验手册第五版

/致谢本手册的出版由UNDP/UNFPA/WHO/世界银行人类生殖研究、发展和研究培训特别规划署与WHO人类生殖健康与研究部共同完成。我们对所有参与本手册筹备、编辑和校订的人员表示诚挚的感谢。另外感谢：MsCathyTreece,MsCharleneTollner和JimOverstreet教授(UniversityofCalifornia,Davis,CA,USA)提供形态学显微照片以与对媒体文件的校对；DrRuneEliasson(SophiahemmetHospital,Stockholm,Sweden)帮助定义非精子细胞；DrGaryNClarke(TheRoyalWomen´sHospital,Carlton,Australia),DrRoelofMenkveld(TygerbergAcademicHospitalandUniversityofStellenbosch,Tygerberg,SouthAfrica)和PieterWranz教授(UniversityofStellenbosch,Tygerberg,SouthAfrica)对本手册编译工作提供附注。衷心感谢国际男科学会提供的经济支持。这个版本的手册是为纪念已故前WHO男性生育调控方法学工作组负责人GeoffreyWaites(1928-2005)，他也是第二、第三和第四版实验室手册的共同编辑。编辑委员会全身心投入工作的动力来自于对Geoff诚实、公平和关心疾苦人格的欣赏。缩写词Abantibody抗体AIartificialinsemination人工授精AIDartificialinseminationwithdonorsemen供精人工授精AIHartificialinseminationwithhusband’ssemen夫精人工授精ALHamplitudeoflateralheaddisplacement头侧摆振幅ANOVAanalysisofvariance变量分析APAAPalkalinephosphatase:anti-alkalinephosphatasecomplex碱性磷酸酶:抗碱性磷酸酶复合物ARacrosome-reacted顶体反应ARTassistedreproductivetechnology辅助生殖技术ASAanti-spermantibody抗精子抗体BCFbeat-crossfrequency(Hz)交打频率BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白BWWBiggers,WhittenandWhittingham试液CASAcomputer-aidedspermanalysis计算机辅助精子分析CASMAcomputeraidedspermmorphometricassessment计算机辅助精子形态评估CBAVDcongenitalbilateralabsenceofthevasdeferens先天性双侧输精管缺失CDcompactdisk压缩盘CDcytoplasmicdroplet胞质小滴CD45clusterofdetermination45(pan-leukocytemarker)决定簇45(全白细胞标记物)CD46clusterofdetermination46(acrosomalantigen)决定簇46(顶体抗原)CIconfidenceinterval可信区间CLconfidencelimits可信界限CO2carbondioxide二氧化碳DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸DPBSDulbecco’sphosphate-bufferedsalineDulbecco’s磷酸缓冲盐溶液DVDdigitalversatiledisc数字多用盘EDTAethylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸（依地酸）EQAexternalqualityassurance外质量保险EQCexternalqualitycontrol外质量控制ERCexcessresidualcytoplasm残余胞质FITCfuoresceinisothiocyanateFMLPformyl-methionyl-leucyl-phenylalanine甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸GIFTgameteintrafallopiantransfer输卵管内配子移植术GPCglycerophosphocholineH2O2hydrogenperoxide过氧化氢HBSSHanks’balancedsaltsolutionHanks’平衡盐溶液HBVhepatitisBvirus乙肝病毒hCGhumanchorionicgonadotrophin人绒毛膜促性腺激素HCVhepatitisCvirus丙肝病毒HIVhumanimmunodefciencyvirus人免疫缺陷病毒HOPhamsteroocytepenetration仓鼠卵穿透HOShypo-osmoticswelling低渗肿胀试验HPFhighpowerfield高倍视野HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HSAhumanserumalbuminxiv人血清白蛋白IVHTFhumantubalfuid人输卵管液IBimmunobead免疫珠IBTimmunobeadtest免疫珠试验ICSIintracytoplasmicsperminjection胞浆内精子注射Igimmunoglobulin免疫球蛋白IMimmotility不动IQCinternalqualitycontrol内质量控制IUinternationalunit国际单位IUIintrauterineinsemination宫腔内人工授精IVFinvitrofertilization体外受精KRMKrebs-RingerMediumKrebs-Ringer培养液LINlinearity线性LLQlowerlimitofquantifcation定量下限LPFlowpowerfield低倍视野MADmeanangulardisplacement平均角位移MAImultipleanomaliesindex复合异常指数MARmixedantiglobulinreaction混合抗球蛋白反应NAnumericalaperture数值孔径NPnon-progressive(motility)非前向的（活力）PBSphosphate-bufferedsaline磷酸缓冲盐溶液PDCAplan,do,check,actPMAphorbol12-myristate13-acetate(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐PMSGpregnantmareserumgonadotrophin孕马血清PNPGp-nitrophenolglucopyranoside对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷PRprogressive(motility)前向的（活力）PSAPisumsativumagglutinin碗豆凝集素QAqualityassurance质量保险QCqualitycontrol质量控制RCFrelativecentrifugalforce相对离心力RIrefractiveindex屈光指数RNAribonucleicacid核糖核酸ROSreactiveoxygenspecies活性氧类物质rpmrevolutionsperminute每分钟转速SDstandarddeviation标准差SDIspermdeformityindex精子畸形指数SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SEstandarderror标准误SOPstandardoperatingprocedure标准操作流程STRstraightness(VSL/VAP)直向TBSTris-bufferedsalineTris缓冲盐溶液TGGTyrode’sglucoseglycerolTZIteratozoospermiaindex畸形精子症指数VAPaveragepathvelocity平均轨道速率VCLcurvilinearvelocity曲线速率VSLstraight-line(rectilinear)velocity直线速率WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织WOBwobble(VAP/VCL)摆动第1章背景1.1导言鉴于人类精液检查标准化需求的日益增加，世界卫生组织于1980年首次出版了《世界卫生组织人类精液与精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》。至今，该手册已改版三次，被译成多国语言。过去30年中，该手册作为全球范围内的标准被世界各地的临床与科研工作者广泛使用。尽管前几版的发行很成功，但是随着新证据的出现，先前版本中的一些推荐指标需要被修正就变得更明显了。同时，对一些概念也需给出更多的解释和支持证据。出于上述考虑，WHO成立了编辑委员会，回顾手册中描述的各种方法，本版旨在修改、更新这些内容。由于按照先前版本中讲述的方法获取的数据不充分，某些情况下修正工作变得异常困难。有时，某些实验室可以获得的一致结果，在其他实验室却无法得以验证。鉴于这些情况，编辑委员会在对以往文献资料评估后，达成一致，统一标准。由于需要对先前版本中讲述的方法进行更详细的描述，技术员和科学工作者们给出了补充推荐内容。因为前几版手册缺乏对细节的描述，一些实验室采用其它方法或是发展出自己的操作规程，然而他们却仍申称是按照WHO手册进行精液分析的。为了使全球范围内的比较更容易实现，第五版手册包含了更多的细节描述。当提出不同的分析方法时，手册中对原由做了解释。参照该手册在发表论文中报道实验结果时，我们推荐各个实验室要指明所采用的是哪一种方法。1.2第5版第5版包含三部分内容：精液分析（第2-4章），精子制备（第5、6章）与质量评估（第7章）。第Ⅰ部分介绍精液分析，参照先前版本，但被分为三个小章节：标准化方法（介绍决定精液质量的常规操作流程）；可供选择的试验（这些试验用于某些特定情况下或由实验人员选择）；研究试验（这些试验目前不作为精液常规分析的方法）。由于通常在男科学实验室不能开展精液培养，因此这些内容仅在无菌化精液标本采集部分提与。精子制备章节的内容从射出精液扩展到对睾丸和附睾获得精子的制备。本手册中散在分布的方法学注释框有注解(方法学解释)、评论（结果解释）以与说明框(包括补充解释的物质)。第5版手册的主要特点如下所列：精液分析章节包括涉与工作溶液的配制、操作流程、精子计数与对结果解释的详细描述，以使所有给出的方法学都非常完整，与手册中其它章节内容的重叠极少。扩展了精子制备部分的内容，增加了关于精子冷冻保存的新章节。与宫颈粘液分析相关的操作规程被分到可供选择的试验章节与附录中粘液特征的检查部分。与先前的版本相比，第五版的附录内容减少。这部分内容仅限于特殊的或者很少被用到的信息。精子数目的评估。对于一份精液标本的检查，精液的稀释度和评估精子数目所需观察的计数池区域的大小均有所改变，每次需计数200条精子。新版手册中强调了抽样误差的重要性与计数结果的确定性。编辑委员会认为每次排精的总数目比精子密度能更准确的评估睾丸功能，但这要求对精液量的测定需准确无误。无精子症的评估。这尽管表面看起来简单，但很多因素会影响无精子症的诊断，包括计数太少数目精子导致的明显误差，观察显微镜视野的数目，以与检验布满碎片精子沉淀物的困难度。本手册推荐改为检验固定后、未离心的标本，以与指出所用计数方法的灵敏度。然而，当需收集足够数目的精子用于治疗时，离心方法仍是必需的。另外，手册中也介绍了通过检验未固定标本中的活动精子以评估输精管切除术疗效的方法。精子活力的评估。第五版与先前版本的主要不同在于对精子活力的分级。目前推荐精子活力被分为前向运动、非前向运动的不动精子（而不再分为a,b,c和d级）。精子形态的评估。一些实验室仅仅评估正常精子的比例，然而有些人认为形态异常的类型、部位与程度更加重要。质控。此章第五版为重新编写。精液分析过程的健全对于精液分析严格质控至关重要。当质控结果不满意时，文中的提示和建议有助于增进实验室水平。参考范围和参考低值。本手册参考范围值来自12个月以内配偶获妊娠的男性的精液数据。原始数据为来自3大洲的8个国家的可生育男性的400-1900份精液样本。传统统计学方法为取双向参考区间的第2.5百分位作为阈值，低于此阈值则可认为来自不同的人群。但是，单向参考区间更适用于精液分析，因为任意参数的高值并不能对生育作出决定性的判断。第5百分位可作为最低参考值，每一参数的完全分布区间见附录1。1.3本手册的范围本手册所载的方法可作为指南以增进精液的综合分析和可比性。但并非为地方、国家或全球性的实验室认证机构所必备。精液分析在临床和研究机构对男性生育功能的调节和追踪中，其对男性生育状态和精子发生的监控都是极为必要的。（上海交通大学医学院附属第九人民医院生殖中心曹少峰博士）第2章标准程序2.1简介正常精液是一种混合物，在射精时由睾丸和附睾的分泌液与悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。最终射出的混合物是一种粘稠的液体，即射出的精液以团块状连续数次射出，通过输精管切除术前后的比较显示，就体积而言有90%是自附属腺体的分泌物，其中主要是前列腺和精囊腺，少部分来自尿道球腺和附睾。精液的两个主要量化指标：1．精子总数，反应睾丸的生精状况和睾丸后管道系统的通畅程度。2．体积反应腺体的分泌能力。精子功能组要受精子自身的活力、运动、形态和精浆成份的影响。在性交排精时，最初富含精子和前列腺液部分的精液可能和延续在阴道中宫颈粘液丝相互接触，而其余部分在形成而在实验留取标本时，全部精液留取在一个容器中，精子限在由精囊腺分泌蛋白导致的凝块中，随后在前列腺分泌的酶作用下而水解。有证据表明精液样本质量的变化与取样方式和地点有关，通常在家里用性交法留取的质量较高，说明不同排精方式明显影响样本的检验结果。在固定条件下精液样本质量主要受睾丸生精功能、附属腺体的分泌、近期患病情况尤其高热性疾病，与其以它如禁欲时间的长短，这些在解释监测结果时都应考虑进去。精液质量分析结果主要受以下因素的影响：1．样本收集是否完整。射精时前面富含精子部分的精液避免丢失，后面部分精液主要是由精囊腺的分泌物构成，所以，前面部分精液的丢失比后半部分丢失对精液分析结果影响更大。2．在射精时，附属腺体分泌物冲淡含高度浓度精子的附睾液。精子浓度不能直接反应睾丸的精子产量，因为还受其他生殖器官功能的影响，而精子总数（精子密度X精液体积）精子密度对于年轻人和老年人没有区别，但精子总数可能存在差异，至少人群中有部分人存在随着年龄增大而精液体积和精子下降的现象。3．精子的活力和染色体不受禁欲时间长短的影响，除非附睾功能受到影响。由于前次射精不彻底，附睾没完全排空，有部分精子残存，精子老化会影响精子质量，其程度很难确定，所以也很少做考虑。4．睾丸体积的大小不仅能反应睾丸的生精水平还影响到每次射精的精子总数和精子形态。注释：精液质量的巨大生理变化是上述所列多种因素的反映(Castilla等.,2006)，因而同精液相关的所有分析都要精确全面。这些多变的非可控因素解释了众所周知的个体精液成分的变化(Baker&Kovacs,1985;Alvarez等,2003).图2.1显示了参与一个雄性激素避孕药研究的安慰剂组的5名年轻志愿者，根据WHO推荐的方法的精液评估结果，其精液成分是伴随时间发生变化的。这一变化表明要对精液分析进行如下说明：1．仅凭一次精液检查不能确定精子质量。2．检查两到三次有助于获得可靠的基本数据(Poland等,1985;Berman等,1996;Carlsen等,2004;Castilla等,2006;Keel,2006)。虽然对整个精液样本进行了分析，但其结果并不能确定那些少数到达受精部位精子的受精能力，精液分析能为临床提供有关患者个人状况的一些重要信息。样本的采集和检查都按照规范化程序进行，其结果才有价值。本章所述操作流程被认定为进行精液评估的基本组成步骤。图2.1在超过18个月的时间内精子总数目和精液浓度的变化（以上数据提供由先灵葆雅和拜耳药业提供）精液分析包括以下几个步骤（在以后章节中详述）：【在最初五分钟】将受精精液样本容器放置在温控台或水浴箱里（37℃在30到60分钟期间评估精液的液化情况和物理性状。测量精液体积。如有需要则检测精液的pH值。准备湿片观察显微镜下精子的活动情况，计数时还需进行稀释。如活动精子较少，需评估精子活动率。制作精液涂片评估精子形态。对精液进行稀释后做精子密度评估。对精子进行计数。如有需要可进行抗免疫珠混合反应检测。如发现圆形细胞则可检测过氧化酶阳性细胞。如有需要可对精子做免疫珠试验的准备。如需检测精浆生化指标则对精液进行离心。【在三小时内】将精液样本送至微生物检验室（如有需要）。【四小时后】对精液涂片进行固定、染色以备精子形态学检查。【在当日稍后（如冷冻样本则可在次日）】检查附属腺体功能的指标。进行间接免疫珠试验检测（如有需要）。2.2样本采集2.2.1准备为了减少外界温度和样本收集到检测期间过长对精液检测结果的影响，样本采集应在靠近实验室比较私密的房间里进行。缩短样本从采集到检测的间隔时间，标本采集时间应为禁欲至少两天，最长不超过七天。如需复查每次禁欲的天数应尽可能恒定。给患者一个明确的书面或口头有关采样指导说明，应该强调样本收集必须完整，如有样本丢失与时告诉医生。在报告中应包括如下信息：患者姓名、出生日期、禁欲时间、采样日期、样本是否完整、采样是否困难与从采样到检测的间隔时间。2.2.2为了诊断和研究目的样本采集应用手淫的方法取精液，并射入一干净的、广口的玻璃或塑料容器中。应通过实验证实容器对精子没有毒性作用(见框2.1)。盛有精液的容器应放置在20～37℃将盛有精液样本的容器置于恒温台或水浴箱中，等待其液化。报告中应注明样本采集是否完整，尤其富含精子的射精最初部分。如有丢失应在禁欲2～7天后再次采集作进一步检测。

评述2.1精液收集管兼容性的判定选取若干精子浓度高且精子活力佳的精液样本。每份标本的一半置入已知无毒的容器（对照）内，另一半置入待测容器。室温37℃2.2.3用于辅助受孕的精液样本的消毒对于用来临床诊断，但收集样本容器、吸头与用来混匀的吸管同样要进行消毒。2.2.4对要进行微生物检测精液样本的采集这时，必须要避免来自精液以外的污染（外周皮肤）收集样本容器、吸头与用来混匀的吸管同样要进行消毒。患者需按下列步骤进行：排尿；用肥皂清洗手和阴茎；冲去残留肥皂；用一次性毛巾擦手和阴茎；射入干净的容器中。注：精液样本的收集和实验室显微生物操作开始的时间间隔不可超过3小时。2.2.5家中样本采集对于除了在自家以外的环境下取精的确困难者，可以在家中进行样本采集。给患者以明确的书面或口头形式的有关精液样本的采集和转运指导说明，应强调采集样本必须完整，如有部分丢失应在报告中加以说明。对已标上姓名和身份证号的容器进行称重，然后交给患者。患者应记录采集的时间，并在一小时内送至实验室。在送至实验室途中样本应保持在20～37℃的环境中。报告中应注明样本采集的地点是在家还是在其他实验室以外的地方。2.2.6用避孕套采集样本对通过手淫法采集精液困难的情况下，才采用避孕套通过性交法获取精液。只能用经特殊设计对精子没有毒性的避孕套来采样，这种避孕套现已有售。应告知患者使用避孕套方法以与如何将样本转运至实验室。应记录样本采集的时间，并在一小时内送至实验室。在送至实验室途中样本应保持在20～37℃的环境中。报告应注明样本的采集是在利用避孕套通过性交法与采集地点。注：一定不可使用普通避孕套收集精液，因为它们一般含有干扰精子活力的成分(Jones等,1986).注释1:体外射精不是精液收集的可靠手段，因为含有大量精子的精液初始部分可能遗失。而且，这可能造成样本的细菌性或真菌性污染，且阴道内的酸性环境会对精子活力造成不利影响。注释2：如果患者无法提供精液样本，性交后试验（见3.3.1节）可能会提供其精子情况的相关信息。2.2.7样本的安全处理精液样本可能含有害的病原体（如乙肝病毒、HIV），应作为生物污染物处理，如是为了宫腔内人工授精、体外受精、单精子胞浆内注射、培养，注意消毒应严格按照附录2中安全处理指南进行，实验室试验应以安全为基础。2.3初步肉眼观察精液液化后经简单观察应立即进行检查分析，最好在30分钟内完成，不要超过一个小时。以免水分丢失或温度的变化而影响精液质量。2.3.1液化精液射入容器后立即形成典型的半透明凝块，室温下在数分钟内，精液通常开始液化（变稀），此时可以看到不均匀的凝块在液体中。随着继续液化，精液将变成均匀的水样物，最后只看到很小的凝块，室温下一般在15分钟内通常都能完全液化，很少超过60分钟。如在60分钟内没完全液化，应记录这种情况，在家或利用避孕套采集的样本通常在送达实验室时都已液化。正常精液可以含有不液化的胶冻状颗粒，这一现象似乎没有任何临床意义。粘液丝的出现可能干扰精液分析。注1：液化可以通过宏观（如上所述）和微观两方面来断定。固化精子可通过精液液化而获得运动能力。如果在显微检测中观察到固化精子，则需更多时间以保证液化过程的完成。注2：在液化过程中，持续轻柔的混匀或旋转样本容器可以降低精液密度测定过程中的误差。注3：如果精液在30分钟内未液化，不要进行任何精液分析，而应再等待30分钟。如果在60分钟内精液仍未液化，则参照2.3.1.1节进行处理。2.3.1.1液化延迟偶有精液不液化，需另行处理，机械混匀或用酶消化可能是必要的。1．加入等量的培养液(如杜氏磷酸盐缓冲液,详见附录4，A4.2节)，然后重复用加样器吹打也可以使某些样本液化。2．用带有规格为18或19号注射针头的注射器对精液进行反复抽吸6～10次。3．用菠萝蛋白酶或糜蛋白酶(EC3.4.22.32)的消化作用可以促进精液液化（见框2.2）。制备方法为10IU/l的菠萝蛋白酶置入杜氏磷酸盐缓冲液（见附录A4.2）4．对液化确困难的精液，可以将样本与酶按比例(1:2)进行混匀置于37℃注释：这些处理可能会影响到精浆的生化性质，精子活力以与精子外形，如有使用必须记录。用菠萝蛋白酶以1+1（1:2）的方式稀释精液必须在评估了精子浓度后以其结果作为说明。2.3.2精液粘稠度液化后，用口径约1.5mm的塑料吸管缓慢地将精液吸入，观察在重心作用下精液形成粘液丝的长度，正常时为液滴不间断落下，异常时粘液丝长超过2cm，也可以观察用玻璃棒插入精液提起后形成粘液丝的长度，超过2cm即为异常，这都应作记录。部分不液化样本，表现为精液粘稠度不随时间延长而改变，对于那些高度黏稠的样本减轻粘稠的方法同处理精液液化延长相同(见2.3.1.1注释：高粘稠度会干扰对就精子活力、密度的判定以与对覆盖在精子表面的抗体和生化标志物的检测。2.3.3精液外观正常精液液化后应呈均质、灰白色的外观。如果精子密度非常低，精液可显得透明一些。如有红细胞，精液可呈红褐色；病人如有黄疸或服用某些维生素，精液可呈黄色。2.3.4精液体积精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睾分泌物构成，体积的精确测量对评估精液非常重要，他影响精液中精子总数和非精子细胞数的计算。最佳办法是采集样本容器的称重。用事先称重的一次性清洁容器收集样本；给装有样本的容器称重；减去容器的重量；根据样本重量计算体积，假定精液密度为1g/ml精液密度在1.043和1.102g/ml之间(Huggins等,1942;Brazil等,2004a;Cooper等,2007))。注：空样本容器可能具有不同的重量，所以每一容器必须提前分别称重。用不退色标记笔在容器上标明或粘贴标签标识其重量。如粘贴标签标识其重量，应在称重前即粘贴标签。此外，可以直接测量精液体积。将精液直接射入广口带有刻度的锥形底量筒中，器材均可从市场上购得。从量筒上直接读取数值（精确到0.1ml）。注：不推荐用移液器或是注射器从标本容器中吸取样本然后注入量筒中测量体积，因该方式无法保证不损失样本，而这会导致对体积的低估。该法导致的体积损失量在0.3到0.9ml之间（Brazil等，2004a；Iwamoto等，2006；Cooper等,2007）。注释1：低精液体积是生殖道梗阻或先天性双侧输精管缺如（CBAVD）(delaTaille等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000)的特征。同时也可能是精囊发育不良的一个表现。注释2：低精液体积也可能是在精液收集过程中产生了问题（如损失了部分精液），也可能为部分逆行射精或有男科缺陷。注释3：高精液体积可以反映附属性腺分泌旺盛，可能存在活动炎症的情况。2.3.4.1参考值下限精液体积的参考值下限为1.5ml（95%置信区间（CI），1.4-1.7）。2.3.5精液pH值精液pH值主要反映出由精囊腺分泌的碱性液体和由前列腺分泌的酸性液体之间的平衡情况。应在精液液化30分钟后进行，无论如何不要超过1个小时，以免因CO2丢失而影响检测结果，正常情况下选用范围在6.0到10.0之间的试纸。均匀搅拌样本(见框2.3)。将一滴精液在pH试纸上均匀展开。等待浸湿区域的颜色均匀一致（等候时间＜30秒）。与标准带比色读出其pH值。注：pH试纸的准确性应该按照已知标准进行检测。对于粘稠的样本，可取小份样本用专为测量粘稠溶液设计的pH量尺进行检测。(Haugen和Grotmol,1998)。2.3.5.1参考值对于生育男性精液pH值的参考值尚未确定，现保持原有下限值7.2。注释1：如低体积低精子数目的精液样本的pH低于7.0，可能存在生殖道梗阻或先天性双侧输精管缺如（CBAVD）(delaTaille等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000)。同时也可能是精囊发育不良的一个表现。注释2：精液的pH值如随时间推移而升高，可能是由于自然缓冲物减少，所以高pH值不能提供有价值的临床信息。2.4显微镜初检建议使用相差显微镜对所有未染色的新鲜精液标本进行检查，初检的总放大倍数为100倍（即物镜10×和目镜10×），对标本进行一般观察包括：粘液丝；精子凝集；非精子细胞包括：上皮细胞、圆形细胞（白细胞和未成熟精子细胞）与断裂的精子头部或尾部，这应在总放大倍数为200或400倍的条件下进行；评估精子活力(见2.5节)；根据精子计数要求决定稀释倍数(见2.8节)。2.4.1充分混匀精液和取样充分均匀液化的精液本身就有利于解决化验取样是误差的问题，如样本不够均匀，观察同一份精液制备两份标本有关精子活动、活力、密度与形态等结果时可能出现明显偏差，为了给生育力的评估提供可靠资料，在检测前，精液样本必须充分混匀(见框2.3)，两等份的数值必须相符才可接受测量结果。两份标本经泊松分类的精子数目（见框2.7和2.10，表2.4和2.5）和其百分率的二项分布（见框2.5和2.6，表2.1）需要一致。框2.3充分混匀精液：在取微量样本进行检测前，样本必须在容器内充分混匀，力度要轻柔以免气泡产生，可通过向样本中插入一个宽孔（直径接近1.5mm）的一次性无菌塑料吸液管抽吸10次来达到混匀标本的目的。不可用高速涡旋器，以免对精子造成损伤。2.4.2湿片的制作充分混匀精液样本（见框2.3)；混匀后立即取样，以免精子在悬液中沉淀；再次取样前还需进行混匀，进行分析检查时精液体积和盖玻片的尺寸必须标准化，以保持精子在固定厚度约20µm条件下自由游动将10µl的定量精液滴在干净载玻片上；盖上22mm×22mm的盖玻片，形成近20µm厚度，盖玻片的重量使标本均匀展开；应注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡；对新制成的湿片，等到玻片上界面不再晃动时应尽快进行检测。框2.4湿片的厚度：涂片的厚度（Dµm）是样本的体积（V，µl=mm3）除以它的液面宽度（A，mm2）：D=V/A。如，体积为10µl的精液置于一张洁净的载玻片上，加盖面积为22mm×22mm的盖玻片（面积为484mm2），则其厚度应为20.7µm；若体积为6.5µl的样本上加盖一张18mm×18mm的盖玻片（面积为324mm2），则其厚度为20.1µm；如体积为11µl的样本上加盖一张21mm×26mm的盖玻片（面积为546mm2），则其厚度为20.1µm；偶尔会出现大厚度的情况，如40µl的样本上加盖一张24mm×50mm的盖玻片（面积为1200mm2），则其厚度为33.3µm；注1：涂片的深度小于20µm会限制精子的旋转运动(LeLannou等,1992;Kraemer等,1998)注2：如厚度过大，则会因为精子在视野中来回运动而难以进行精子评估。注3：如每一视野中精子的数目差异过大，则样本可能是不具有代表性的。如出现此种情况则应重新充分混匀精液标本（见框2.3）并按照上述步骤重新制备一张涂片。注4：欠缺代表性也可能会导致粘稠度和液化的异常（见2.3.1节），精子的聚集（见2.4.3节）或精子的凝集（见2.4.4节）。2.4.3精子聚集不活动精子之间、活动精子与粘液丝之间、非精子细胞成分或细胞碎片等粘在一起，为非特异性聚集（图2.2），这种情况应如实记录。图2.2精液中精子的非特异性聚集图示为精子与上皮细胞（a），细胞残渣（b）与精子（c，d）的聚集现象。显微图像由CBrazil提供2.4.4精子凝集精子凝集是指活动精子以不同方式，头对头、尾对尾或混合型，如头对尾，彼此粘在一起。剧烈震荡会使精子活力过度表现，但有时由于凝集会限制精子的活动力。任何精子的头部，尾部或中段有粘附现象都应如实记录。凝集的类型（反应其程度（1-4级））和吸附状态（A-E级）也应记录（Rose等,1976）（见图2.3）。一级：轻度聚集指每个凝块中少于10条精子；二级：中度聚集指每个凝块有10到50条精子，精子运动自如；三级：大片聚集指每个凝块有多余50条精子，精子仍然运动自由；四级：整个精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互连接。根据程度又可分abcd。注：运动的精子粘附于细胞，细胞碎片或是非运动的精子（聚集）应该记为凝集。图2.3精子聚集程度分类表涉与部分聚集等级完全分离聚集精子数＜10个，多数精子为游离状态中等聚集聚集精子数10~50个，有游离精子高度聚集聚集精子数＞50个，部分精子游离完全聚集所有精子均聚集一团，无游离精子1．轻度聚集指每个凝块中少于10条精子；2．中度聚集指每个凝块有10到50条精子，精子运动自由；3．大片聚集指每个凝块有多余50条精子，精子仍然运动自由；4．整个精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互连接。A．头对头B．尾对尾C．尾端对尾端D．混合型E．纠结型注释1：存在凝集并不能充分证实为不育的免疫性原因，但是能够说明有抗精子抗体的存在；还需进一步检查以明确诊断（见2.20节）。注释2：严重的精子凝集能够影响对精子活力和密度的评估。2.4.5其他非精子细胞成分精液中常含有一定的非精子细胞成分，部分与临床关系密切。通常包括泌尿生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞，后两种统称为“圆细胞”(Johanisson等,2000)。这些细胞成分在染色后的涂片中（放大1000倍）难以区别(见2.12节,表13和14,以与2.19节)。可以通过过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗原技术来进行鉴别。非精子细胞成分计数用与精子相同的方法进行，或根据染片(见2.18.1.5节)中生精细胞或白细胞与精子的比例来进行计算。（山东中医药大学第二附属医院生殖中心董乾江苏无锡妇幼保健院生殖中心王洪华）2.5精子活力分析精子活力程度与妊娠率有关，电脑辅助法评估精子的运动性见第3.5.2节。精子活力评估应在精液样本液化后尽快（最好在30分钟之内）进行，务必在射精后1个小时之内进行。防止时间过长，因脱水、pH值与温度的变化对评估结果产生的负面影响。过程如下：·将精液样本混匀。·拌匀后立即（防止精子沉淀）取出一等份。·重新搅拌精液样本的剩下部分，取出另一等份。·将上面的两份样本分别滴大约20µm深的湿制剂（见2.4.2节）的载玻片上。·等到样本停止悬浮（1分钟以内）。·用200或者400倍率的相差显微镜观察载玻片。·每个标本大概评估200个精子左右，以便算出各自不同类型精子的百分比。·若标本的观察值在可接受的范围，记录下数据，否则重新制作标本。注1：该过程应该在室温或者显微镜载物台预先加热至37℃的标准试验室内进行，如果在37℃下进行评估，精液样本需要放置在37注2：建议采用带有网格标线的目镜以便选择观察区域，先数积极运动型精子数量，然后数非积极运动型精子数量，最后评估完全不动型精子数量。（见2.5.1节）。2.5.1精子活力分类建议采用一个简单的精液运动分类方法，该方法根据精子运动功能的不同分成以下几类：·运动活跃型（PR）：精子运动活跃、线性运动或者在较大的范围内运动（不考虑运动的速度）。·非运动活跃型(NP)：精子运动但不活跃，如精子在较小的范围内运动，精子头部轻微移位或尽有鞭毛摆动。·完全不动型（IM）：精子完全不动。注1：该手册之前的版本介绍的分类方法将积极活跃型根据精子运动速度的快慢进行细分，如将在37℃注2：当讨论精子活动率时，细分精子的总能动性（PR+NP）和活跃精子能动性（PR）非常重要。2.5.2精液样本的准备和评估如果在37℃的温度下评估，提前10分钟开启恒温箱，以确保温度恒定在37·准备20μm深的计数板（见2.4.2节）。·用200或者400倍率的相差显微镜观察载玻片。·等到样本停止悬浮。·在离盖玻片至少5μm的区域内观察精子的运动（盖玻片边缘的精子运动性受到干燥物质的影响）。·系统性地观察载玻片以防止重复观察同一个区域，不断改变观察区域，避免基于精子活动数量多少来选择观察区域（观察区域选择应该随机）。·计数开始时间的选择应该随机，计数要迅速，不要等到精子游到所选区域后才开始计数。·评估所选区域的所有精子的活动率，区域选择最好通过目镜标线来确定，选择区域的大小应根据精液的浓度，如当精液浓度较大时，选择最上面一排网格，浓度低时，选择全部的网格。·计数应该迅速，避免运动精子的数量估计值比实际值多，快速计数网格内的精子，避免因计数时间过长，将计数时游进网格的活动精子也计算入内而导致估计值多于实际值。·首先数所选区域内的运动活跃型精子（PR），然后是非运动活跃型精子（NP），最后是完全不动型精子（IM）。根据经验，也可以同时计数一个网格内的三种类型的精子然后再数另一网格内的三种类型的精子，直到将所选区域数完。·通过实验室计数器的辅助完成计数。·每个标本至少在5个不同的区域计数，所数的精子总数应该不低于200个以避免小样本错误。分别计算两个标本的PR、NP和IM比例，然后计算各自的均值和差值。将计算的结果对照表2.1（在95%的置信区间内，在某一均值下，两个比例差距可接受的最大值）。参照表2.1若两个比例差值在可接受范围之内，记录PR、NP和IM比例的均值，若差值过大，超过可接受范围，重新制作2个精液标本。通过四舍五入记录PR、NP和IM比例均值的整数值。注1：仅计数完整的精子（有头部和尾部，见2.7.3节）不要计数只能看见小部分的精子。注2：活性精子计数时往往会多数，要通过改变计数顺序（如先数NP精子数或IM精子数），尽可能知到潜在影响计数的偏见（见7.13.3节）并避免它们。注3：有时，样本不均匀，即使三个标本都不能得到可接受的差值，这时，记录下两两的均值与差值。图2.4目镜标线对活性精子计数很有帮助（图a），系统性地选择计数区域，计数范围应该至少距盖玻片5μm（图b）。表2.1在某一均值下，两个比例差距可接受的最大值（每个标本计数200个精子的情况下）。框2.6：关于百分比的比例值和差值处理百分比要四舍五入成整数，若尾数是0.5则将其转换至离两者均值较近的整数，如将32.5%写成32%，而将3.5%写成4%。这些四舍五入成的百分比全部加起来可能不等于100%。对照表2.1，若两个标本PR、NP、IM比例的差值刚好等于可接受的最大差值，则接受该值。若差值大于可接受的最大值，一般认为是数错了、吸取错误或者精液样本没有搅拌均匀。当差值大于可接受的最大值时，不要采纳之前的数据，而应重新制作标本重新计数。（千万不要再做一份相同的标本，计算三个标本的平均值，或者选择数据接近的两个计算平均值）。2.5.3示例例1：某两份精液标本（每个标本的精子数均大于200）的精子能动性分析如下，运动活跃型精子分别占30%和50%；非运动活跃型精子分别占5%和15%；完全不动型精子分别占65%和35%。占比例最大的为完全不动型，它们的均值为50%。对照表2.1，在均值为50%的情况下，差值大于10%，认为仅是偶然发生事件。观察值大于10%（65%-35%），因此需重新制作两份标本进行评估。例2：某两份精液标本（每个标本的精子数均大于200）的精子能动性分析如下：运动活跃型精子分别占37%和28%；非运动活跃型精子分别占5%和6%；完全不动型精子分别占60%和66%，占比例最大的为完全不动型，它们的均值为63%。对照表2.1，在均值为63%的情况下，两者差距大于10%，认为仅是偶然发生事件。观察值小于10%（66%-30%），因此，接受该观察值，并记录如下：运动型精子占32%，非运动型精子占4%，完全不动型精子占63%。2.5.4参考下限总运动精子（PR+NP）比例的参考下限为40%（95%的可信度，38-42的可信区间）；积极运动精子（PR）比例的参考下限为32%（95%的可信度，31-34的可信区间）。注：一次射精的精液中的运动活跃型精子总数具有生理上的意义，它的值等于精液中的总精子数乘以运动活跃型精子的比例。2.6精子活率精子活率的评估通过精子细胞膜的完整性程度来完成，通常每个样本都可以评估其活率。尤其当积极活跃型精子比例小于40%时，评估精子活性就非常必要。这时，精子活性评估可以检验精子能动性评估的正确性，因为死亡精子的比例不应该超过完全不动型精子的比例，存活精子的比例应该超过运动精子的比例。别举活精子的比例通过评估精子细胞膜的完整程度来完成，而细胞膜的完整程度评估运用染色排除法或低渗透肿胀法。染色排除法基于以下原理：损坏的细胞膜，例如死亡细胞膜，允许有色物质进入；渗透肿胀法则假设：在低渗透压溶液中只有拥有完整细胞膜的细胞才会肿胀。下面将会对这两种方法分例。精子活率的评估应在精液样本液化后尽快（最好在30分钟之内）进行，务必在射精后1个小时之内完成。防止时间过长，因脱水与温度的变化对评估结果产生的负面影响。注1：临床上，知道完全不动型精子是否是活的非常有必要，因此，精子活率的评估要在精子能动性评估结果的基础上进行。注2：若出现完全不动且为活性精子的比例较大的情况，则提示精子鞭毛存在结构性缺陷；若完全不动且为死亡精子比例较大则提示附睾存在病理。2.6.1曙红（伊红）－苯胺黑法评估精子的活率这种方法通过苯胺黑染色剂，只需要一个步骤，增强精子头部颜色与背景颜色的对比度，很容易就可以看出精子是否具有活率。将染色后的精液制成标本放到显微镜下观察。2.6.1.1准备试剂1.曙红Y：将0.67克曙红和0.9克氯化钠溶入到100毫升纯净水中，并轻微加热。2.曙红—苯胺黑：将10克苯胺黑加到配好的100毫升的曙红Y试剂中。3.将其加热至沸腾，然后冷却至室温。4.用滤纸（如90g/m2）滤掉渣滓与凝胶状沉淀物，然后存储于黑色密封的玻璃瓶内。2.6.1.2步骤1.将精液样本拌匀。2.将1/5的精液与5μl伊红溶液混合，置于显微镜载玻片上，用移液管混匀，在载玻片上均匀展开。3.重新搅拌精液样本，然后重复步骤2制作另外相同一份。4.将两份样本的悬浮液分别涂抹在不同的载波片上（见2.13.2节），然后置于空气中风干。5.标本干后立即观察，或者将其置于永久非水介质（见2.14.2.5）中，以后再观察。6.用100倍的油浸物镜观察。7.在实验室计数器的辅助下，计数已被染色的精子（死亡精子）和没有被染色的精子（活性精子）数量。8.为了避免样本错误，每个标本至少要数200个精子。9．分别计算两个标本活性精子的比例，以与两者之间的差值。10.对照表2.1（在某一均值下，两个比例差距可接受的最大值）以确定差值是否可以接受。11.若均值可以接受，记录下两个标本活性精子比例的平均值，否则，重新制作两个相同的标本并且重复以上步骤。12.用四舍五入法记录所得的比例值。图2.5在明场视野镜下观察曙红—苯胺黑精液标本图头部变红的精子（D1）或者暗红（D2）的精子认为是死的（细胞膜受损）；头部为白色（L）或者淡粉色的精子认为是活的（细胞膜完整）。2.6.1.3计数1.苯胺黑使整个标本的背景成为黑色，因此容易分辨被染色的与未被染色的精子。2.在明场视野显微镜下，活精子具有白色头部，而死精具有红色或暗红色头部（见图2.5）,淡红色头部的精子认为是活的。3.如果精子头部仅有小部分被染色，认为是颈膜泄漏，不是细胞死亡和全部膜破坏的迹象。这种情况下认为该精子是活的。2.6.1.4正常参考下限活精子（细胞膜完整精子）比例的参考下限为58%（置信度为95%，置信区间为55-63）。注：一次射精量中（见2.8.7节），精子细胞膜完整的精子总数具有生理学意义，可以通过精子总数乘以具有完整精子细胞膜的比例得到。2.6.2仅用曙红（伊红）染料评估精子活力该方法简单快速，但所制备湿片无法储存以用于质量控制。2.6.2.1试剂的制备1.NaCl，0.9%（w/v）：将0.9gNaCl溶于100ml净化水中。2.曙红Y染剂，0.5%（w/v）：将0.5g曙红Y（比色指数，45380）染料溶于100ml浓度为0.9%的NaCl溶液中。注：一些商用曙红溶液是会对精子结构造成破坏的低渗溶液，这会造成假阳性结果。如果使用这种溶液，需向100ml溶液中添加0.9g的NaCl以提高渗透压。2.6.2.2操作步骤1.充分混匀精液样本（见框2.3）。2.吸取5μl的精液样本，同5μl的曙红溶液在载玻片上混匀。可使用移液器头在载玻片样本上充分搅拌以保证混合均匀。3.用22mm×22mm的盖玻片覆盖，反应30秒。4.重新混匀精液样本，重新吸取样本，重复上述步骤2和3。5检验所制备的玻片，以放大倍数为200或400倍的负相位光学显微镜（正相位目镜难以辨明染为淡粉色的头部）检验为佳。6.用实验室计数器来计数染色（死亡）和非染色（存活）细胞的数目。7.为了达到可接受的低样本误差，每张玻片评估200个精子（见框2.5）。8.统计所制备的两张玻片中活动精子的平均数和百分率的差异。9.以表2.1或是图A7.2，附录7为标准（在仅考虑样本误差的前提下，均显示95%的样本其两个百分率的最大差异是可以接受的），推断是否为可接受的差异。10．如果其百分率上的差异是可以接受的，则可报告其活力的平均百分比。如果差异过高，则重新制备标本再次进行评估（见框2.6）。11.所报告的精子活力的百分比应尽可能涵盖所有的精子数目。2.6.2.3计分1.存活精子的头部染色为白色或淡粉色，死亡精子的头部染色为红色或深粉色。2.如果染色仅限于颈部区域，剩余的头部未染色，则可认为是“颈部细胞膜不全”，这并非是细胞死亡和细胞膜崩解的标志，此类细胞应被认为是存活细胞。3.如果难以辨识浅染的头部，可使用苯胺黑以增加背景的对比度(见2.6.1节)。2.6.2.4正常参考下限活精子（细胞膜完整精子）比例的参考下限为58%（置信度为95%，置信区间为55-63）。注：一次射精量中（见2.8.7节），精子细胞膜完整的精子总数具有生理学意义，可以通过精子总数乘以具有完整精子细胞膜的比例得到。2.6.3活精子的低渗膨胀检验作为一种可供选择的染色排除方法，低渗膨胀（HOS）检验可以用于评估精子的存活情况（Jeyendran等，1984）。当无法进行染色时，如选择用于ICSI的精子，该法为最有效地评估方法。细胞膜完整的精子在低渗介质中会于5分钟膨胀，且其形状会在30分钟内保持稳定(Hossain等,1998)。使用方法：·如为常规诊断用途可孵化30分钟·如果为治疗目的则只可孵化5分钟2.6.3.1试剂制备1.用于诊断的膨胀液的制备：将0.735g二水柠檬酸钠和1.351g右旋果糖溶于100ml的净化水中。该溶液需保存于-20℃2.如用于治疗用途，以1+1（1：2）的比例用无菌净化水溶解介质。2.6.3.2操作步骤1.使用前溶解膨胀液充分混匀。2.以37℃3.充分混匀样本（见框2.3）。4.吸取100μl的精液样本并添加膨胀液。用移液器缓慢抽吸混匀。5.37℃下准确孵化5分钟或30分钟（见上），之后取10μl液体置于洁净的载玻片上，加盖22mm×22mm6.按上述步骤，再次混匀精液样本，再次吸取标本，混入膨胀液，孵化，再次制备涂片。7.用放大倍数为200或400倍的光学显微镜检测涂片。8.用实验室计数器辅助计数未膨胀（死亡）和膨胀（存活）的细胞数目。9.为了保证较低的样本误差，每张涂片计数200个精子（见框2.5）。10.统计所制备的两张玻片中活动精子的平均数和百分率的差异。11.以表2.1或是图A7.2，附录7为标准（在仅考虑样本误差的前提下，均显示95%的样本其两个百分率的最大差异是可以接受的），推断是否为可接受的差异。12.如果其百分率的差异是可以接受的，则可报告其活力平均百分比。如果差异过高，则重新制备标本再次进行评估（见框2.6）。13.所报告的精子活力的百分比应尽可能涵盖所有的精子数目。2.6.3.3计分1.通过细胞形状的改变来确认膨胀的精子，如显示为尾部卷缩（图2.6）。2.精子尾部有膨胀表现则可认定为存活精子；将所有尾部膨胀的精子均计为存活精子。图2.6低渗膨胀状态下的人类精子的典型形态变化表现示意图（a）无变化（b）—（g）不同的尾部变化灰色区域提示为肿胀的尾部。2.6.3.4正常参考下限HOS检验的参考值接近于曙红检验的参考值（Carreras等，1992）。活性精子（细胞膜完整精子）比例的参考下限为58%（置信度为95%，置信区间为55-63）。注释：一次射精的精液中的精子细胞膜的完整性的总数目是有生物学意义的。细胞膜完整的精子数目可通过一次射精的总精子数乘以细胞膜完整精子的百分率来获得。2.7精子计数每次射精时精子的总数和精子浓度均与妊娠的时间(Slamaetal.,2002)与妊娠率(WHO,1996;Zinamanetal.,2000)有关，可通过其预测受孕(Bondeetal.,1998;Larsenetal.,2000)。此推论已为生殖率与精子总数之间关系的诸多资料所证明。射精时精子的数量，是由鉴定精液得出的精子密度来统计。对于正常射精，当男性生殖道是通畅的且禁欲时间短，每次射精时的精子总数均与睾丸容积有关(Handelsman等,1984;WHO,1987;Andersen等,2000;Behre等,2000)，所以，精子总数是衡量睾丸成生精子的能力(MacLeod&Wang,1979)与男性生殖道通畅的指标。与受精和妊娠率相关的精液中精子浓度受精囊(Eliasson,1975)和前列腺分泌多少的影响，并非是睾丸功能的特异性指标。注释1：“精子总数”一词与“精子密度”一词并非同义词。“精子密度”指的是每单位体积精液中精子的数量，是射出的精子数目与液体稀释体积的函数。“精子总数”指的是一次射精时全部精液中的精子总数，由精子密度乘以精液体积获得。注释2：一般说来，一次射出时的精子总数反映了睾丸的生精能力，但脊髓损伤、雄激素不足、延长禁欲后采集的样本或不完全逆行射精的病患则是例外。注释3：当精子密度（每单位体积的数）有意义时，“精子密度（每单位体积的量）”一词不应使用。精子计数的确定包括以下步骤（后续的细节章节有详解）：·在载玻片上涂抹液化后未稀释的混匀精液样本，覆上盖玻片进行检验，以确定适于使用的稀释度和计数池（见2.8.1）。这即是通常用于鉴定活力的湿片（见2.4.2）。·将精液与加入固定剂的稀释液混合。·让精液充填血细胞计数器的一个计数池。·10－15分钟内评估样本（干燥后会在数精池内出现明显精子痕迹）。·每次重复至少计数200条精子。·比较每次重复的计数以了解其是否在可接受的误差范围。如是，则继续计算；如否，则准备新的稀释。·计算每ml精子密度。·计算每次射精的精子总数。2.7.1计数池类型推荐使用100μm深血球细胞计数器为计数池，因Neubauer（牛鲍氏）血球细胞计数器改良后的稀释因素更适宜。使用另外深度的血细胞计数器计数池，有着不同的深度和网格模式，要求不同的计数因子。所使用的计数池对决定精子密度是有效的(Seaman等,1996;Mahmoud等,1997;Brazil等,2004b)，但改良后的Neubauer血球细胞计数器得到的结果将会不同。通过毛细管作用填充的浅计数池，由于流动精子不会均匀分布(Douglas-Hamilton等,2005a,2005b)。该误差能够被校正(Douglas-Hamilton等,2005a)，但校正并非是完全正确的(Björndahl&Barratt，2005)。这种可选择的计数池，其有效性须经计数池核查量纲来确定(见附录7,A7.8节)，将Neubauer改良的血细胞计数器法得出的结果加以比较，获得如客观的质量控制程序所显示出的满意操作性能。为实现低密度精子的精确鉴定，需采用大容积的数精池(见2.11.2)。2.7.2改良的Neubauer（纽鲍尔氏）血球细胞计数器改良的Neubauer血细胞计数器有两个隔开的计数池，每个计数池均在玻片上gridlines蚀刻出显微镜下可见的3mm×3mm模式，采用专用的厚载玻片(厚度4号,0.44mm)，由0.1mm玻璃柱支撑，覆盖网格。每个计数区分成九个1mm×1mm网格。这些网格见图2.7中数字所示。图2.7改良的Neubauer（纽鲍尔氏）血球细胞计数器蚀刻区略图如下所示：血球细胞计数器计数池的所有九个网格（左边面板）；25个大方格中的中央网格（5号）（中间面板）；显微镜下已充填的一个数精池的部分（右边面板），即中央网格的25个方格之一（中间面板的圆圈所示），其由三重线围出，包含16个小方格。2.7.3血球细胞计数器网格的使用·只对整个精子（包括头和尾）进行计数。·以精子头部位进行计数；尾的定向不重要；方格的边界由三线的中间线标明，所以，需统计精子头的大部分是否位于两条内线之间，而并非大部分头部在两条外线之间(图2.8,左面板)。·为避免毗邻方格内的同一精子的重复计数，头部位于划分两个毗邻方格的线上的精子，应只计两条垂直界线之一上的精子。例如，精子大部分的头部低于L型(见图2.8,中间面板)中央界线或在其左边的，可计数，而中央界线上方或右边的不予计数（见图2.8,右边面板）。注意：如果有头部缺失的精子尾（针头）或无尾精子，在报告中应记录。若有需要，其浓度应通过与正常精子计数同样的方法进行评估(见2.8)，或其在精子中的比率可由染色法确定(见2.17.6)。2.7.4计数器的维护血球细胞计数器计数池须用专用的厚盖玻片(厚度4号,0.44mm)。·使用后，用水清洗血细胞计数器数精池和盖玻片，然后用相机（镜头）专用纸充分干燥，这样可避免干燥后的任何杂质残留。摩搓网格方格可除去先前样本的任何残留物。·在消毒剂中过夜浸泡可重复使用的数精池和盖玻片(见附件2,A2.4部分)，避免污染精液中潜在的传染因子。三线的中间线确定了方格的边界（黑线，左边面板）。除头部在两条内线之间（白圈）的精子之外，方格中央的所有精子均计数，但头部在两条外线之间的需计数（黑圈）。头部大部分在中间线上的精子，如果该中线低于方格（白圈，中间面板）或是方格的左手线，则精子需计数，但如果该中线高于方格（黑圈，右边面板）或是方格的右手线则不计数。图2.8网格方格内计数的精子2.7.5稀释后精液的固定1．1000mL纯水中溶解50gNaHCO3和10ml35%(v/v)甲醛溶液。2．如果急需，加0.25g台盼蓝（颜色所引23859）或5mL(>4mg/ml)饱和的结晶紫（颜色所引42555），以加亮精子头部。3．4°C贮藏。若溶液中是以结晶形式存在，使用前用0.45-μ2.7.6计数足够数量精子的重要性为降低样本误差，精子的临界数量（大约200条重复计数时，总数400条以上更合适）（见框2.7和表2.2）。框2.7估计数值时的误差精子数目的估算精度依赖于所计数精子的数目。在泊松分布中，计数（N）的标准误差（SE）是单位体积精液中精子数目的平方根（√N），其95%的置信区间（CI）接近N±1.96×√N（或为N±2×√N左右）。如果计数100个精子，那么标准误差（SE）即为10（√100），其95%的置信区间（CI）是80-120（100±20）。如果计数200个精子，则SE为14（√200），其95%CI为172-288（200±28）。如果计数400个精子，则SE为20（√400），其95%CI为360-440（400±40）。样本误差一般表达为计数的百分比（100×（√N/N））。详见表2.2注意：这些评估仅是大致，因为评估时可信度的间隔不会总是均匀。基于泊松分布的精确的95%可信度间隔，一次计数400条时为361-441条；一次计数100条时为81.4–121条；一次计数10条时为4.80–18.4；一次计数1条时为0.03–5.57；一次计数0条时为0.00–3.70。表2.2参照精子计数总数的圆形样本误差（%）注释1：太少的精子用于计数，将会得出不可确信的结果（见附录7，A7.1节），对诊断和治疗产生影响(见附录7,A7.2)。当精子用于治疗目的以与精子数量少时，这现象不可避免（见5.1节）。注释2：当精液量少以与用于计数的精子少于推荐量时，所获得的数据的精确度将显著下降。如果每次重复少于200条精子，报告样本误差见表2.2。（广西南宁第二医院生殖中心刘峰）2.8常规计数程序如果在计数池4、5和6大方格或是其中之一中有大约200条精子，那么按1+4(1：5)和1+19(1：20）稀释是合适的（见表2.3和框2.8）。框2.8每次重复计数时改良纽鲍尔氏计数池中央3个大方格的精子数达到200。在初始的湿片制备中，如果容积为4nl的每高倍视野（参阅2.9）有100条精子，理论上精子密度为25/nl(25000/μl或25000000/ml)。由于改良纽鲍尔氏计数池的中央大方格（5号方格）容积是100nl，则其内的精子数目将是2500。以1+4(1:5)倍数稀释样本将会调整每个大方格精子数量为500，这样可获得足够低的抽样误差。在初始的湿片制备中，如果每高倍视野有10条精子，则精子密度是25/nl，中央大方格的精子数目是250。建议以1+1(1:2)倍数稀释样本将会调整每个大方格精子数量是125。同样，这可获得足够低的抽样采样误差。注：由于计数的精子数目太少和计算的容积可能不太准确，上述浓度计算只是粗略的估计。未稀释精液样本浓度估计大约是稀释精液样品计数浓度的30％至130%。2.如果要准确测量未稀释精液样本的精子数量，将精液予以稀释是必要的，这种方法也通常用于在湿片制备中评测精子活力（请参阅2.4.2节）。如2.4.2节中所述制作湿片并检测其中之一，估计每高倍视野(×200或×400)的精子数。每高倍视野大约相当于16nl(在×200)或4nl(在×400）的容积（请参阅框2.9）。如检测到精子，则按照2.8.2节的步骤予以计数，并根据表2.3确定需要的稀释度。如果检测不到精子，则检测另一湿片。如果在第二张湿片中仍没有检测到精子，按照2.9节的步骤进行。框2.9池深为20μm的湿片中每高倍视野的容积每个显微镜检测视野包含的精液量取决于该区域的面积（πr2，其中π大约是3.142，r为显微镜检测视野的半径）和池的深度（湿片制备中大约是20.7μm）。显微镜视野的直径可以用镜台微尺测量，或可以通过目镜的光圈直径除以物镜的放大倍数来估算。如使用×40的物镜和口径为20mm×10目镜，则显微镜视野的直径大约500μm(20mm/40)。这种情形下，r=250μm，r2=62500μm2，πr2=196375μm2，而该区域的容积是4064962μm3或大约4nl。如使用×20的物镜和口径为20mm×10目镜，则显微镜视野的直径大约是1000μm(20mm/20)。这种情形下，r=500μm，r2=250000μm2，πr2=785500μm2，而该区域的容积是16259850μm3或大约16nl。表2.3精液所需稀释度、配制方法、使用的计数板和评估区域每×400视野的精子数每×200视野的精子数所需稀释度所需精液量（μl）所需固定液（μl）使用的计数板评估区域>101>4041：20（1+19）50950改良纽鲍氏方格5、4、616-10064-4001：5(1+4)50200改良纽鲍氏改良纽鲍氏2-158-601:2(1+1)5050改良纽鲍氏改良纽鲍氏<2<81:2(1+1)5050改良纽鲍氏或更大容积整块玻片的9个方格注1：白细胞移液管和依靠空气置换原理的自动移液管并不足以将粘性精液准确稀释，建议使用正向置换型移液管。注2：就诊断而言，用于分析的精液样本不应小于50μl，以避免因小容量样本而造成的抽样误差。注3：如在推荐的稀释倍数下每视野可见的精子数目太少，则以更低的稀释倍数制备另一个湿片。如在推荐的稀释倍数下每视野有太多的重叠精子，则以更高的稀释倍数制备另一个湿片。注4：如果1+19(1:20)稀释不合适，则使用1+49(1:50)稀释。注释1：如果初始湿片制备中精子数目太低(每×400高倍视野<4：大约1×106/ml)，此时可不要求计算准确的精子数量（请参阅2.10）。注释2：为准确评估低密度精子（每×400高倍视野<2：大约0.5×106/ml)，建议对改良纽鲍尔氏计数池板的9个大方网格全部计数（请参阅2.11.1），或使用大容量的一次性计数板进行荧光检测（请参阅2.11.2）。2.8.2稀释精液并加样于血细胞计数池吹打使血细胞计数池表面微微湿润。将盖玻片紧压支持柱以固定于计数池上，可通过观察两层玻璃之间的虹彩（多重Newton环）来确认盖玻片是否正确置放：光线越多，位置越合适；如只有1-2条光线则提示计数池深浅不一。采用正向置换型移液管将适量的固定剂（见表2.3）分配到两个稀释瓶中。将精液样本混匀（请参阅框2.3）。混匀后立即吸入适量的精液，以避免精子从悬浮液中沉降（见表2.3）。将移液管尖端的精液擦拭干净，小心以避免碰到尖端的开口。将精液加入固定剂中，反复吸压以洗刷移液管尖头部。重新将精液样本混匀，按以上步骤重复另一份稀释。将第一次稀释的液体置于振荡器以最高的速度振荡10秒钟以充分混匀，立即吸取大约10µl的悬浮液以避免精子沉降。将移液管尖端仔细触碰其中一个计数池v型槽的下缘。慢压移液管枪栓，通过毛细管作用使样本充满计数池。在充池过程中盖玻片不应有移动，且计数池不应过满（此时可看到盖玻片有移动）或不满（此时可见计数池内有气泡）。如上将第二次稀释的液体混匀，并立即吸取10µl悬浮液。重复以上步骤对另一计数池充池。将血细胞计数板平放置于湿盒内（例如放在浸透水的过滤纸上并盖上皿）以免干燥，在室温下储存至少4分钟。这段时间不动的细胞将沉淀在方格内。注1：有些计数池是由磨砂玻璃支持柱构成，此时将不出现Newton环。在每侧的磨砂玻璃支持柱边滴注1.5µl的水可使盖玻片保持其位置不变，但小心不要让水渗入计数区域。注2：使用血细胞计数板夹保持盖玻片位置不变将确保一个固定的池深(Christensen等，2005年)。注3：对于非常粘稠的精液样品，如果混匀过程延迟5–10秒钟，则精液可在稀释液中凝集。遇到这种情况，应在精液添加入固定液后立即旋涡式搅拌10秒钟。2.8.3在计数池中检测精子数量均应在两个血细胞计数池中检测精子数量。如果两个检测值充分一致，其值可信(参阅第2.4.1节)。在×200或×400放大倍数的光学相差显微镜下检测血细胞计数池。每次至少重复计数200个精子以达到足够低的抽样误差（请参阅框2.7和表2.2）。首先对其中一个改良纽鲍尔氏计数池的中央大方格（图2.7中的5号）逐行进行计数。继续计数直到至少200个精子和完整的一行(包括5个中方格）。计数必须包括完整的一行，不能在一行的中间停止。如果在中央大方格的5行中计数不够200个精子，继续在两个相邻大方格（图2.7第4和6号)的各行中(每行包括4个中方格）计数。将计数达到至少200个精子所需要的行数予以记录，检测另一计数池时也要在相同的行数内计数。借助实验室计算器计算精子的数目和行数。切换至另一计数池，重复计数与第一次相同的行数（相同体积），即便计数结果少于200个精子。计算两次计数的总数和差异值。根据表2.4或附录7图A7.1确定差异的可接受性(均显示在95%的可信区间内，单纯抽样误差允许的两个数值的最大差异值。)。如果差异可以接受，则计算精子密度（请参见2.8.4）；如果差异太大，则如章节2.8.2所述重新进行双份稀释并重新计数（请参阅框2.10）。取两个有效数值的平均值作为精子密度予以报告。计算每次射精的精子总数(参阅2.8.7节)。注1：如果在4、5和6号大方格中计数少于200个精子，不要继续在1、2、3、7、8或9号大方格中计数，因为这些大方格中每行的容积不同于4、5和6号大方格(参阅2.7.2节)。这种情况下，可降低稀释倍数进行双份稀释和计数。如果需要1+1(1:2)稀释，则按章节2.11的步骤进行。注2：对同一计数池进行两次计数或对同一次稀释填充的两个计数池进行计数都不是真正的重复计数，因为这样并没能对采样、混合与稀释所造成的误差进行检测。框2.10重复计数的比较两个相对独立数值的理想差异值为0，其标准差等于两个数值之和的平方根。因此在95%的可信区限内(N1–N2)/(√(N1+N2))应该小于1.96。如果两个数值之间的差异值小于或等于表2.4或表2.5给出的数值，则评估可被接受，精子密度可计算为两个数值的均值。较大的差异值则意味着可能发生计数