博士论文答辩幻灯yang课件

损伤反应性星形胶质细胞对成年大鼠压迫性脊髓损伤的再生作用

专业：外科学

研究生：杨平林

导师：贺西京

教授研究背景

神经干细胞在成年动物中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）中的存在，打破了CNS损伤后神经元不能再生的观念，使CNS损伤修复成为可能。近年来研究表明，在成年哺乳动物的大脑皮层、海马齿状回、室管膜下层、纹状体、脊髓中央管室管膜区等部位证实有神经干细胞存在。研究背景和前脑、海马甚至视网膜相比，有关成年哺乳动物脊髓中神经干细胞的研究却远远滞后，脊髓神经干细胞（可能存在于脊髓中央管周围的室管膜区）的培养却一直到1996年才得以成功。随后又发现，神经干细胞/神经前体细胞广泛分布于整个脊髓实质，包括灰质和白质，并不是从脊髓中央管室管膜周围产生并迁移而来的。存在和尚需解决的问题中枢神经系统损伤最常见的是反应性星形胶质细胞增生，在损伤修复过程中，其具有数量多、出现早、变化快、易分化、易形成瘢痕等特点，这说明损伤反应性星形胶质细胞增生对CNS损伤修复存在有利和不利的双重作用。那么在反应性星形胶质细胞增生过程中，某些或某时期反应增生性星形胶质细胞是否共同表达特异性神经干细胞标志物—巢蛋白（Nestin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP），是否具有干细胞特性，非神经元生发区的损伤反应性星形胶质细胞是否可以作为神经干细胞来源？目前都尚未见详细报道，有必要进一步研究。存在和尚需解决的问题在文献复习中，我们知道某些星形胶质细胞中存在着干细胞，可作为神经干细胞的来源。由此，我们推测脊髓损伤后星形胶质细胞高表达Nestin很可能预示着它们发生了“去分化”而处于相对“幼稚”的干细胞或前体细胞状态。这些细胞从位置上可简单地分为两类，一类位于脊髓中央管周围；另一类则广泛分布在损伤区附近的脊髓实质中（包括脊髓白质）。研究目的及意义为此，本实验利用动脉瘤夹压迫法建立脊髓损伤动物模型，利用巢蛋白（Nestin）与胶质酸性纤维蛋白（GFAP）作为神经干细胞特异性标志物，应用免疫组织化学和免疫荧光双标技术结合激光共聚焦显微镜、图像分析系统、流式细胞仪以及细胞培养技术，观察了脊髓损伤后不同时期损伤、不同部位Nestin与GFAP的表达变化、细胞类型及其相关性，以及Nestin+/GFAP+共存细胞表达高峰期（损伤后3~7天）的脊髓组织（剔除中央管周围室管膜区）的增殖、分裂和分化能力。

成年大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生和Nestin表达的相关性及意义

Nestin是神经干细胞或前体细胞所特有的一种中间丝蛋白，多出现于早期原始分化的细胞，目前已被广泛用于神经干细胞的鉴定。GFAP是星形胶质细胞的特异性蛋白和骨架成分之一，并可作为其及反应性星形胶质细胞的特异性标记。本部分采用动脉瘤夹压迫法建立成年大鼠脊髓损伤动物模型，着重分析压迫性脊髓损伤后不同时期、不同部位Nestin和GFAP的表达、共表达变化及其阳性细胞的细胞类型。

实验动物与分组

成年8周龄SD大鼠48只，清洁级，由西安交通大学医学院动物中心提供，雄性，体重200~250克，随机分为正常对照组（6只）和模型组（42只），然后于造模后1d、3d、5d、7d、14d、28d和56d分成7小组，每小组6只。所有动物均在室温下饲养。动物模型的建立利用动脉瘤夹压迫法建立成年大鼠脊髓损伤动物模型：用3%的苯巴比妥钠经腹腔麻醉（30mg/kg），无菌条件下，以胸8椎体为中心暴露脊髓，然后以胸9（T9）脊髓节段为中心，在显微镜帮助下用宽度1.2mm，压迫力约为98牛顿（N）的动脉瘤夹压迫脊髓3分钟。术后人工按压膀胱协助排尿每日2次。动物模型的建立附图动脉瘤夹脊髓压迫后动脉瘤夹脊髓压迫术后神经功能评定

T8-10脊髓损伤后不同时期神经功能评定：①采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分标准评价运动功能。②采用HE和甲苯胺蓝染色观察脊髓损伤程度与范围。BBB评分标准评价运动功能，从0分(完全瘫痪)至21分(正常)共22级。BBB评分：第一部(0~7分)评判动物后肢(HL)各关节活动；第二部(8~13分)评判动物HL的步态和协调功能；第三部(14~21分)评判动物运动中爪的精细动作，三项满分21分。损伤后连续评定3d，以后在损伤后不同时间点评定1次，连续8周。神经功能评定脊髓形态学观察：取正常对照组与不同时间点损伤组的脊髓行HE和甲苯胺蓝染色观察脊髓损伤程度与范围。统计学处理：实验数据计量资料用均数加减标准差，两组样本间均数比较采用独立样本t检验(并做方差齐性检验)。取材及标本的制备脊髓损伤动物模型肝素生理盐水及4%多聚甲醛灌注附图取材及标本的制备附图压迫术后24h大体标本对照组脊髓大体标本组织化学法根据BBB评分标准评价运动功能及HE和甲苯胺蓝染色后形态学观察结果选取脊髓切片，并将其分为3大组，每大组再依据对照组与实验组分为2小组。第1大组用常规HE和甲苯胺蓝染色，以分析脊髓损伤的范围及程度；第2大组取脊髓切片行免疫荧光单标染色；第3大组行免疫荧光组织化学双重标记染色。封片后用Leica图像采集系统和激光共聚焦显微镜观察结果。BBB评分标准评价运动功能结果

正常对照组所有实验动物均健康存活，双HL评分均为21分。模型组造模过程中因术中出血死亡2只，麻醉意外死亡1只；术后1~2周内不明原因死亡4只，余均存活（根据实验设计要求补足各组缺失的动物）。另外，有2只发生足部及臀部溃疡。BBB评分结果显示：术前所有实验组动物双HL评分均为21分。术后SCI组均呈现双HL完全性瘫痪，与正常对照组相比较具有统计学意义(P<0.05)。术后1d时BBB评分低至0～1分，随后逐渐上升，1～2周内恢复的幅度较大，第3周以后恢复较缓慢，与正常对照组相比较具有统计学意义(P<0.05)。

BBB评分标准评价运动功能结果SCI后BBB评分结果组织病理学结果

HE染色：损伤组可见水肿、出血和小挫伤灶，损伤区与周围区界限不易区分。脊髓损伤24h以后的损伤区范围内可见程度不同、数量不等的染色较深的神经元，呈塌陷或皱缩形状，压迫区域皮质坏死神经细胞增多，可见核固缩和胞浆溶解。正常对照组未见明显改变。组织病理学结果附图对照组脊髓中央管及周围（HE×200）对照组脊髓中央管周围以外的白质和灰质（HE×200）组织病理学结果附图压迫术后24h脊髓中央管及周围（HE×200）压迫术后24h脊髓中央管周围以外的白质和灰质（HE×200）免疫组织化学染色结果

正常对照组：在脊髓中央管的腹侧和背侧，偶可见几根Nestin免疫染色阳性突起，染色强度较弱；GFAP阳性细胞随处可见，细胞排列较整齐。脊髓伤后：损伤24h后，和正常组相比，损伤区域的中央管周围灰质和白质Nestin的表达明显增加，Nestin阳性表达在3~7天逐渐达到高峰，表达区域除损伤区域外，血管周围和室管膜区也有表达，但仍以损伤及邻近区域表达为著，Nestin阳性细胞具有发达的突起，且很粗大；损伤后约3天，GFAP的表达也明显增加，GFAP阳性表达在5~9天逐渐达到高峰，反应性星形胶质细胞肿胀、肥大，突起增多和延长。免疫组织化学染色结果用激光共聚焦显微镜观察到了损伤区及邻近区域的白质和灰质荧光双标的阳性信号，即Nestin阳性突起和GFAP阳性细胞共存，且几乎全是Nestin+/GFAP+细胞，并具有星形胶质细胞形态。然而，损伤及邻近区域的中央管周围室管膜区几乎均为Nestin+/GFAP–细胞。随着时间的推移，Nestin阳性细胞减少，突起变得清晰而纤细；胶质细胞肿胀、肥大较前减轻，突起少且短而清晰。约在损伤后2周左右，共存细胞阳性表达也逐渐减弱，乃至消失，胶质瘢痕形成。免疫组织化学染色结果附图对照组脊髓中央管周围以外的白质和灰质（GFAP）（Red）对照组脊髓中央管周围以外的白质和灰质（Nestin）（Green）免疫组织化学染色结果附图对照组脊髓中央管及周围（GFAP）（Red）对照组脊髓中央管周围以外的白质和灰质（GFAP-Nestin双标）（Yellow）免疫组织化学染色结果附图对照组脊髓中央管及周围（Nestin）（Green）对照组脊髓中央管及周围（GFAP-Nestin双标）（Yellow）免疫组织化学染色结果附图压迫术后5d脊髓中央管周围以外的白质和灰质（GFAP）（Red）压迫术后5d脊髓中央管周围以外的白质和灰质（Nestin）（Green）免疫组织化学染色结果附图压迫术后5d脊髓中央管周围以外的白质和灰质（GFAP-Nestin双标）（Yellow）压迫术后5d脊髓中央管及周围（GFAP）（Red）免疫组织化学染色结果附图压迫术后5d脊髓中央管及周围（Nestin）（Green）压迫术后5d脊髓中央管及周围（GFAP-Nestin双标）（Yellow）免疫组织化学染色结果附图压迫术后14d脊髓中央管周围以外的白质和灰质（GFAP）（Red）压迫术后14d脊髓中央管周围以外的白质和灰质（Nestin）（Green）免疫组织化学染色结果附图压迫术后14d脊髓中央管周围以外的白质和灰质（GFAP-Nestin双标）（Yellow）压迫术后14d脊髓中央管及周围（GFAP）（Red）免疫组织化学染色结果附图压迫术后14d脊髓中央管及周围（Nestin）（Green）压迫术后14d脊髓中央管及周围（GFAP-Nestin双标）（Yellow）损伤不同时期Nestin、GFAP及Nestin与GFAP的共表达时程图

用LeicaQ500IW图像处理系统分析单位面积Nestin、GFAP及Nestin与GFAP共表达积分光密度值（IOD·μm-2）的变化。统计分析显示，在损伤区（中央管周围室管膜区除外），损伤后3天，Nestin和GFAP的表达明显高于对照组（P<0.05）；在损伤区周围（中央管周围室管膜区除外），损伤后5~7天，Nestin和GFAP的表达显著增高（P<0.05），2周后逐渐恢复到对照组水平。损伤不同时期Nestin、GFAP及Nestin与GFAP的共表达时程图附图Nestin表达时程图损伤不同时期Nestin、GFAP及Nestin与GFAP的共表达时程图附图GFAP表达时程图损伤不同时期Nestin、GFAP及Nestin与GFAP的共表达时程图附图GFAP和Nestin共表达时程图成年大鼠脊髓损伤后损伤区神经干细胞的分离培养实验

在实验的前一部分我们观察了脊髓损伤后不同时期、不同部位Nestin和GFAP的表达变化及其细胞类型。结果显示脊髓损伤24h后，损伤区及邻近区域有大量Nestin和GFAP的表达，且激光共聚焦显微镜观察到有Nestin阳性突起与GFAP共存现象（脊髓中央管周围的室管膜区除外），3~7d左右达到高峰，然后随着时间的推移其表达逐渐下降（约在损伤后2周）。提示脊髓损伤可诱导损伤及周围邻近区域Nestin与GFAP的表达，Nestin+/GFAP+共存细胞可能具有神经干细胞/神经前体细胞特性，可能与CNS的修复有关。因此，在本部分实验中，我们对脊髓损伤后Nestin+/GFAP+细胞表达高峰期（3~7天）的脊髓组织（剔除中央管周围室管膜区）进行了神经干细胞培养实验。实验动物与分组及模型的建立成年8周龄SD大鼠24只，清洁级，雄性，体重200～250g，由西安交通大学医学院动物中心提供。随机分为正常对照组（6只）和模型组（18只），然后于造模后3、5d，1w分成3小组，每小组6只。所有动物均在室温下饲养。动物模型建立同前一部分。主要试剂的配制基础培养基：DMEM/F12（1：1）加入B27添加剂。其内包括0.6％葡萄糖(Sigma)、2mmol·L-1谷氨酰胺(Gibico)、3mmol·L-1碳酸氢钠(Gibico)、5mmol·L-1Hepes(Sigma)、25μg·ml-1胰岛素(Sigma)、100μg·ml-1转铁蛋白(Gibico)、20nmol·L-1孕酮(Sigma)、60μmol·L-1丁二胺(Sigma)、30nmol·L-1氯化硒(Sigma)，不含生长因子和血清。主要试剂的配制完全培养基：基础培养基加入表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)20ng·ml-1及碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)20ng·ml-1、肝素40U·ml-1以及抗生素(青霉素100U·ml-1、链霉素100U·ml-1、抗支原体抗生素12.5U·ml-1)。剔除脊髓中央管周围室管膜区的脊髓组织细胞的分离培养

将脊髓损伤术后3～7d内的成年大鼠，用苯巴比妥钠经腹腔麻醉后，无菌条件下暴露脊髓并剥离硬脊膜，以损伤区为中心，迅速切除长约1.0～1.5cm脊髓组织，置入冰冷的D-hanks液中，待脊髓完全冷却变硬后，在解剖显微镜下以脊髓损伤区为中心将所取组织完全横断成两半，借助解剖显微镜用显微镊和虹膜切开刀小心地切取中央管周围的脊髓组织，剔除中央管周围室管膜区脊髓组织，用虹膜剪将损伤区及邻近区域的脊髓组织尽量剪成0～1mm3的组织碎屑。剔除脊髓中央管周围室管膜区的脊髓组织细胞的分离培养用巴斯德吸管将这些损伤区碎屑移入含有胰蛋白酶、透明质酸酶和DNA酶的混合酶液中，在培养箱中消化30min后，移入预先已加有等体积的大豆胰酶抑制剂离心管内，用内径顺序依次减小的热抛光的巴斯德吸管反复吹打，尽可能地将残余的损伤区组织小块机械性分离开来。吹打完毕后顺序用200目和320目铜网过滤。将滤过的液体收集入离心管内，800rpm离心5min，弃去上清液。然后再用基础培养基重悬细胞，800rpm离心5min。如此反复重复5～6次后，用神经干细胞完全培养基重悬细胞，经台盼蓝实验鉴定细胞活力后，调整细胞密度约为5000～10，000个/ml，种入培养瓶内悬浮培养。接种24h后换一次培养液，以后每隔7d半量换液。以上过程均在无菌条件下完成。单细胞悬液中细胞类型的鉴定

获得单细胞悬液并调整好细胞密度后，用巴斯德吸管吸取0.5m1的单细胞悬液接种在事先用Laminin(5ng/μl)包被的盖玻片上，37C孵箱培养(95%O2和5％CO2)2小时后，取出盖玻片，用冷的4％多聚甲醛固定30min，0.01mol·L-1PBS反复漂洗3~5次后，行抗Nestin/GFAP免疫双重染色，以了解这些单细胞悬液中的细胞类型。单细胞悬液中细胞类型的鉴定附图对照组脊髓中央管周围以外的白质和灰质单细胞悬液（GFAP）（Red）对照组脊髓中央管周围以外的白质和灰质单细胞悬液（Nestin）（Green）单细胞悬液中细胞类型的鉴定附图对照组中央管周围以外的脊髓组织单细胞悬液（GFAP-Nestin双标）（Yellow）压迫术后5d脊髓中央管周围以外的脊髓组织单细胞悬液（GFAP）（Red）单细胞悬液中细胞类型的鉴定附图压迫术后5d脊髓中央管周围以外的脊髓组织单细胞悬液（Nestin）（Green）术后5d中央管周围以外的脊髓组织单细胞悬液（GFAP-Nestin双标）（Yellow）单细胞悬液中细胞的细胞周期测定

单细胞悬液的制备、染色与检测：将每次细胞培养过程中用基础培养基重悬细胞（正常对照组和损伤后3~7天的模型组）浓度调整在1×105/ml，各取2ml（n=6）。以上各细胞悬液标本经70%酒精固定，RNA酶处理后，取1×105/ml0.1ml，加入10%鸡红细胞作为内参标准（使变异系数稳定在3%以下），与样品同步染色，加入碘化丙啶（PI）（PI：50mg/L，triton-x1001.0%)1ml，在4C冰箱染色30min，以500目铜网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，即可用流式细胞仪(BectonDickinson公司产品，功率20mv，激发光波长488nm)进行上机检测。单细胞悬液中细胞的细胞周期测定细胞周期计算方法：由计算机判断Go+G1，S，G2+M三期所落道数范围后，落在各期次内的细胞总和即为各期细胞数，通过增殖指数(PI)=(S+G2+M)×100%及S期比例，判定细胞增殖情况。统计学处理：实验结果均用均数±标准差表示，数据处理运用SPSSforWindows10.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，然后用t检验进行每两组间比较。显著性差异水平以0.05和0.01为标准。结果：细胞周期中S期(DNA合成期)及M期(有丝分裂期)的相对含量可反映被测样品中细胞的增殖状况。单细胞悬液中细胞的细胞周期测定附图对照组

对照组

对照组模型组模型组模型组单细胞悬液中细胞的细胞周期测定附表组别G0-G1(%)S(%)G2-M(%)PI(%)对照组93.53±0.615.84±0.280.62±0.166.47±0.61模型组83.72±3.88*15.49±3.04*0.43±0.1015.88±2.56*两组间细胞增殖周期及PI分析比较(x±s，n=6)模型组与对照组相比较，*P<0.01神经干细胞的自我增殖能力鉴定

培养得到的神经干细胞克隆球用机械法传代。简言之，即在解剖显微镜下小心地用巴斯德吸管将一个或数个细胞球尽量吹散(注意操作应轻柔)，形成单细胞悬液后移入离心管中，800rpm离心5min，弃去上清液，然后用神经干细胞培养液重悬后种入培养瓶中。原代培养结束后立刻在相差显微镜下观察，可以看到培养瓶中散在分布有一些圆形或卵圆形的单个细胞，它们大多单个存在，边缘光滑，折光度好，无细胞突起，细胞中央相当于核染色质的部位在相差显微镜下大多发暗，它们与一些形态不一的神经髓鞘碎片共存。神经干细胞的自我增殖能力鉴定在无血清培养条件下，随着培养时间的延长逐渐萎缩、崩解。对培养组织进行进一步追踪观察后发现，在无血清培养条件下，随着培养时间的延长形态不一的神经髓鞘碎片也逐渐增多。同时，在我们的实验条件下，细胞接种3d后，在培养瓶中可发现有一些很小的干细胞克隆球，在相差显微镜下仔细观察可以发现这些干细胞克隆球由数个细胞紧密聚集而成，它们大小接近，细胞边缘光滑、中心膨隆有立体感，因而在形态上和简单的细胞聚集有显著差别。神经干细胞的自我增殖能力鉴定由于培养液中仍有较多的髓鞘碎片，因而这些小的干细胞克隆球有时可被掩盖。然而，原代培养经7～8ｄ半量换液后，光镜下可见悬浮散在多个小细胞团，外观呈桑椹状，边缘呈颗粒样突起，细胞团折光性强，称为神经球(neurosphere)。随着培养时间的延长和多次换液，培养液中的干细胞克隆球数目逐渐增多，球体逐渐增大，而细胞碎屑则逐渐减少。经12～14d神经球逐渐长大，较大的可为肉眼可见的白色小颗粒，此时光镜下细胞球透光程度下降，细胞间排列致密，在瓶底滚动。此时，这些干细胞克隆球即已清晰可见。个别克隆球周围仍可附着有一些细胞碎屑抑或髓鞘碎片。神经干细胞的自我增殖能力鉴定通过对这些细胞克隆球进行神经干细胞的特征性标志物-Nestin免疫荧光染色和多次传代，以证实这些细胞克隆球的自我增殖能力。结果发现，传代后培养瓶中仍然可以长出类似的细胞球，且数目明显增多，表明它们得到了扩增。经过多次传代，结果获得了大量的细胞克隆球。这些结果表明这些细胞球确实是神经干细胞克隆球，并且具有较强的自我增殖能力。神经干细胞的自我增殖能力鉴定附图模型组中央管周围以外的白质和灰质单细胞悬液初次接种（倒置显微镜×100）模型组中央管周围以外的白质和灰质单细胞悬液接种后7d（倒置显微镜×100）神经干细胞的自我增殖能力鉴定附图模型组中央管周围以外的白质和灰质单细胞悬液接种后14d（倒置显微镜×100）原代培养经多次半量换液后，克隆球清晰可见（倒置显微镜×100）神经干细胞的自我增殖能力鉴定附图经1~2次传代培养后，克隆球数目明显增多（倒置显微镜×100）克隆球免疫荧光染色（Nestin）（Green）对照实验

成年正常对照组大鼠，在无菌条件下切取大致同样长度、同样部位的脊髓组织后，然后如前所述的实验方法获取单细胞悬液，调整细胞密度5000～10，000个/m1，然后种入与实验组相同条件下的培养液及培养瓶内悬浮培养。在对照组实验中，可见许多细胞或髓鞘碎片，偶可发现有少许散在分布的圆形或卵圆形的单个细胞，轮廓清楚，无细胞突起。培养7～10d后，培养瓶中可以观察到为数不多的小细胞克隆球生长。随着培养时间的延长，细胞碎屑也逐渐增多，飘浮在培养液的表面，未见明显的细胞克隆球生长。对照实验附图对照组中央管周围以外的单细胞悬液初次接种（倒置显微镜×100）对照组中央管周围以外的单细胞悬液接种后7d（倒置显微镜×100）对照组中央管周围以外的单细胞悬液接种后14d（倒置显微镜×100）诱导分化实验

将培养获得的神经干细胞克隆球接种在包被有多聚赖氨酸(5ng/μl)的盖玻片上，用含有10％胎牛血清的神经干细胞培养液进行诱导。诱导18h~24d后选择贴壁比较牢靠的干细胞和分化不同时期的盖玻片，放入4％多聚甲醛中固定30min。经用0.0lmol·L-1PBS(pH7.4)彻底清洗后，随机分为五组：第一组行抗Nestin免疫染色；第二组行抗GFAP免疫染色；第三组行抗β-tubulinIII免疫染色；第四组行抗galactocerebroside免疫染色；第五组行免疫荧光双标染色。染色方法和步骤同前。

诱导分化实验诱导分化24h时，细胞体积较小，呈梭形或三角形，开始发出短的突起。行免疫荧光标记显示这些细胞球强烈表达神经干细胞的特征性标志物-Nestin，免疫染色呈强阳性。到第4~7d时，细胞逐渐变大，突起变长，可见到多个突起。免疫荧光染色可以看到这些细胞球中充斥有大量的Nestin免疫阳性的胞体及其突起，突起呈丝状或条索状，在细胞球内错综缠绕，反复交织。并可伸出球体，放射状向周围伸展。诱导分化实验行β-tubulinIII染色结果证实这些分化的细胞克隆球中含有大量的β-tubulinIII免疫染色阳性细胞，它们大多也表达Nestin，提示它们具有朝神经元方向分化的能力。GFAP染色结果则与β-tubulinⅢ染色结果相类似，在荧光显微镜下观察可以看到细胞球内有很多GFAP染色阳性的胞体和细胞突起，并且大都与Nestin+细胞共存。和β-tubulinⅢ染色结果相比，GFAP标记的细胞数目较多，从而提示这些神经干细胞朝星形胶质细胞方向分化的速度可能要快于朝神经元方向分化的速度。此外，也有一部分Nestin+细胞和galactocerebroside（GalC）免疫阳性的细胞共存，提示它们可能朝少突胶质细胞方向分化。诱导分化实验诱导分化12d时，GFAP标记染色显示克隆球分化为大量的GFAP免疫染色阳性细胞，形态与星形胶质细胞极为相似，而GalC和β-tubulinIII染色结果均为阴性，提示它们可能已经分化为成熟的星形胶质细胞；β-tubulinIII标记染色显示克隆球分化为较多量的β-tubulinIII免疫染色阳性细胞，形态与神经元细胞极为相似，而GFAP和GalC染色结果均为阴性，提示它们可能已经分化为成熟的神经元细胞；GalC标记染色显示克隆球分化为较少量的GalC免疫染色阳性细胞，形态与少突胶质细胞极为相似，而GFAP和β-tubulinIII染色结果均为阴性，提示它们可能已经分化为成熟的少突胶质细胞。诱导分化实验附图克隆球诱导分化24h后（倒置显微镜×100）克隆球诱导分化3d后（倒置显微镜×100）诱导分化实验附图克隆球诱导分化8d后（倒置显微镜×100）克隆球诱导分化24h后（GFAP）（Red）诱导分化实验附图克隆球诱导分化24h后（Nestin）（Green）克隆球诱导分化24h后（GFAP-Nestin双标）（Yellow）诱导分化实验附图克隆球诱导分化5d后GFAP（Green）-Nestin（Red）双标染色（Yellow）克隆球诱导分化7d后β-TubulinIII（Green）-Nestin（Red）双标染色（Yellow）克隆球诱导分化7d后GalC（Green）-Nestin（Red）双标染色（Yellow）诱导分化实验附图克隆球诱导分化10d后GFAP单标染色（Green）（×100）克隆球诱导分化14d后GFAP单标染色（Green）（×100）诱导分化实验附图克隆球诱导分化10d后β-TubulinIII单标染色（Red）（×100）克隆球诱导分化14d后β-TubulinIII单标染色（Red）（×100）诱导分化实验附图克隆球诱导分化10d后GalC单标染色（Green）（×100）克隆球诱导分化14d后GalC单标染色（Green）（×100）讨论大量实验证实在成年动物的大脑皮层、海马齿状回、室管膜下层、纹状体、脊髓中央管室管膜区有神经干细胞存在。脊髓损伤后损伤区室管膜细胞显著增殖，室管膜周围区可见Nestin+/GFAP-细胞群，损伤区出现大量的Nestin+/GFAP+双标神经元，表明损伤后室管膜细胞有迁移。这与我们实验结果是一致的。又有研究表明，某些星形胶质细胞中存在着干细胞，可作为神经干细胞。这就提示，在特定的条件下，成年动物CNS中静止的神经干细胞可恢复其增殖分化能力，而成熟的神经细胞也可返回到幼稚状态，表达发育期的蛋白，这些都可能在损伤后的修复过程中发挥重要作用。讨论基于以上研究，我们采用动脉瘤夹压迫法建立动物模型，探讨了成年大鼠脊髓损伤后脊髓内中间丝蛋白Nestin和胶质酸性纤维蛋白GFAP的变化及细胞类型。正常成年大鼠脊髓实质中（除脊髓中央管及其周围组织外），仅在软膜下的脊髓白质中分布有微弱的Nestin免疫阳性结构。脊髓压迫损伤后，Nestin表达明显增加，除上述区域外，在损伤区域及其周围均有表达。从诱导表达的时程来看，在损伤区及周边，损伤后1天，Nestin表达明显增高并持续到2周，在损伤区外周部分，损伤后3天，Nestin表达明显增高，2周后逐渐恢复到对照组水平。这一表达模式与脊髓损伤后诱导GFAP的变化相似。讨论从区域来看，在损伤区，损伤后3天，粗大的Nestin阳性突起围绕损伤中心区形成明显的界限，2周时Nestin突起变得清晰而纤细；在损伤周边区，损伤后3天和1周可见大量Nestin阳性突起，2周时Nestin突起减少。用LeicaQ500IW图像处理系统分析单位面积Nestin和GFAP积分光密度值（IOD/ųm2）的变化显示，这一表达模式也与脊髓损伤后诱导GFAP的变化相似。本研究用免疫荧光双标观察到绝大部分Nestin阳性细胞与GFAP阳性细胞共存（室管膜区除外），根据细胞的形态学特点显示它们是星形胶质细胞及反应性胶质细胞。讨论结果表明，Nestin蛋白可以在增生的反应性胶质细胞中表达。虽然脊髓损伤后诱导Nestin和GFAP大量表达的机制还不十分清楚，但在脊髓损伤后，结合Nestin和GFAP的表达时程和区域变化，我们推测，脊髓损伤诱导Nestin的表达机制可能类似于诱导GFAP的机制。这种损伤后脊髓内不同区域Nestin表达变化不一，也反映了Nestin表达可能与损伤程度有关。损伤区及周边Nestin和GFAP的长期表达可能是神经细胞抵御损伤的继发性保护反应，也很可能是损伤反应性星型胶质细胞使内源性神经干细胞有“静息”状态活化，或者是损伤反应性星型胶质细胞发生了“去分化”而获得了神经干细胞的能力。讨论本研究还观察到，有些Nestin阳性细胞形态与反应性星型胶质细胞极为相似，而无典型的的神经元的形态特征。由此我们推测，压迫性脊髓损伤可引起星形胶质细胞反应，反应性星形胶质细胞表达Nestin，这可能是反应性胶质细胞去分化，变成双向潜能干细胞(aneuron/astrocyteprecursorcell)，表达神经元和胶质细胞表型。另一种可能是损伤诱导多潜能干细胞分化为反应性星形胶质细胞。虽然损伤后反应性星形胶质细胞增生诱导Nestin表达的调控机制还不清楚，但这种诱导作用提示中枢神经系统损伤后与发育相关的基因被激活，并可能参与神经细胞的修复。讨论自我更新和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特性。研究表明，在胚胎乃至成体的脊髓室管膜下都有干细胞存在，在发育期，这些干细胞通过自我复制来增殖，满足发育期生成大量细胞的需要，同时部分子代细胞分化为神经元和神经胶质细胞；在成年期，这些细胞通常处于静止状态，只有在损伤后才表现为增生活跃，但多分化为星形胶质细胞，参与胶质瘢痕的形成。又有研究表明，在体外对脊髓神经干细胞进行诱导分化，依次分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元细胞，具有多分化潜能。讨论近几年一系列研究认为，成年哺乳类的星形细胞是NSC，在体外，星形细胞可长成具多潜能的神经球，并可分化成星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞；在体内，星形细胞或它们的亚群，如同成年哺乳类动物CNS内新增殖的神经元前体细胞，提示它们的作用与该区域的干细胞相同。Lang等研究又发现，损伤反应性星形胶质细胞也许可以获得有潜能的神经干细胞。讨论在本实验中，我们分离压迫性脊髓损伤后高度表达Nestin+/GFAP+细胞的中央管周围的室管膜区以外的灰质和白质，制成单细胞悬液，采用EGF和bFGF在体外成功培养具有很强增殖能力的脊髓神经干细胞并证实了其多分化潜能特性，同时也探索了成年大鼠脊髓中损伤反应性星形胶质细胞有可能是多潜能的神经干细胞/神经前体细胞，可为干细胞的基础研究和临床应用提供理论依据和干细胞资源。讨论能不断分裂增殖是神经干细胞的重要属性。在我们的实验中，成年大鼠脊髓损伤及邻近区域室管膜以外脊髓组织的原代培养细胞及次代培养细胞具有克隆能力，在连续传代培养中依旧维持了这种克隆能力。星形胶质细胞可能具有神经干细胞∕神经前体细胞特性。研究证实，位于神经生发区（如SVZ和SGZ等）的胶质细胞具有干细胞特性，在生长因子的存在下能在体外形成神经球；辐射状胶质细胞也可能是发育期的祖细胞。讨论来自非神经元发生区（如脑皮质和脊髓的室管膜区以外的白质与灰质）的胶质细胞在体外与bFGF或bFGF/EGF共同培养，它们也具有多向分化潜能性并产生神经元。在新生小鸡视网膜，Müller胶质细胞也能产生神经元。最近也有研究证实CNS中的损伤反应性星形胶质细胞也很可能具有神经干细胞特性。越来越多的证据表明，胶质细胞是CNS内的一种潜在的干细胞。讨论我们通过对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞的增生和巢蛋白（Nestin）的表达情况、观察并分析其细胞类型和相关性及这些细胞的分裂、增殖和分化等情况研究，结果显示，分离的成年大鼠脊髓损伤后中央管周围的室管膜区以外的脊髓灰质与白质中Nestin+/GFAP+细胞群具有自我更新能力和多分化潜能，表达神经上皮干细胞蛋白，有很强的分裂增殖能力，具备了神经干细胞的基本属性，是中枢神经系统的干细胞。

讨论其机制很可能是损伤反应性星型胶质细胞使内源性神经干细胞有“静息”状态活化，或者是损伤反应性星型胶质细胞发生了“去分化”而获得了神经干细胞的能力。星形细胞在成年神经再生中具有独特的地位。星形细胞为CNS内存在的细胞，在体内微环境下有分化为神经元的潜能，作为细胞替代治疗CNS损伤具有优势和可行性。结论及创新点（1）成年大鼠压迫性脊髓损伤可诱导损伤及邻近区域Nestin和GFAP高度表达，中央管周围室管膜区几乎均为Nestin+/GFAP–细胞，中央管周围室管膜区以外的灰质和白质中几乎全是Nestin+/GFAP+细胞，并具有星形胶质细胞形态。提示星形胶质细胞和神经干细胞都对脊髓损伤都有反应，可能参与中枢神经系统损伤修复；反应性星形胶质细胞增生与Nestin的表达密