PCR技术的原理操作及应用

PCR技术原理、操作及应用湖南省疾病预防控制中心微生物检验科黄一伟PCR技术的原理操作及应用第1页什么是PCRPCR:Polymerasechainreaction，即聚合酶链反应是80年代中期发展起来体外核酸扩增技术

PCR技术的原理操作及应用第2页PCR技术发展历史关于PCR文章首次由美国科学家KaryMullis等人在《Science》杂志上发表《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶（生活在温泉中水生嗜热杆菌内提取到一个耐热DNA聚合酶）发觉,预示着分子时代到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMullis因PCR创造取得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理操作及应用第3页PCR技术原理1遗传物质：细胞核染色体

DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基组成)碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列，碱基序列长度和排列次序决定了生物多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述0.1%差，人和人之间有3百万个碱基正确差异。PCR基本工作原理就是以拟扩增DNA分子为模板，以一对分别与模板互补寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保留复制机理沿着模板链延伸直至完成新DNA合成。PCR技术的原理操作及应用第4页PCR技术原理2PCR反应基本成份包含7种基本成份：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子基本反应步骤：变性--退火--延伸最终经过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出PCR技术的原理操作及应用第5页PCR技术原理31234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~35轮目标DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR技术的原理操作及应用第6页RT-PCR原理相对于PCR，在开始阶段增加步骤：RNAcDNA合成，是单链到双链过程。PCR技术的原理操作及应用第7页实时荧光定量PCR原理1实时荧光定量PCR技术

(Real-TimeQuantitativePCR)

是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析方法。惯用荧光定量PCR试剂：SYBRGreenITaqman水解探针PCR技术的原理操作及应用第8页实时荧光定量PCR原理2基线（Baseline）是指在PCR扩增反应最初数个循环里，荧光信号改变不大，靠近一条直线，这么直线即基线。光阈值threshold设定普通将PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差10倍，荧光域值设定在PCR扩增指数期。CT(Cyclethreshold)值表示每个PCR反应管内荧光信号抵达设定域值时所经历循环数。研究表明，各模板CT值与该模板起始拷贝数对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数对数，纵坐标代表CT值。所以，只要取得未知样品CT值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。PCR技术的原理操作及应用第9页实时荧光定量PCR原理3Ct与初始模板关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比初始DNA量越多,荧光到达阈值时所需要循环数(Ct值)越少起始模板对数浓度与Ct呈线性关系，依据样品Ct值就可计算出样品中所含模板量阈值104103102PCR技术的原理操作及应用第10页PCR技术优点优点:

特异敏感快速、简便易自动化等PCR技术的原理操作及应用第11页PCR技术不足为了构建特定引物，使特定DNA序列选择性扩增，必须有一个庞大已知序列数据库。聚合酶链反应效率差异很大，依据不一样原因需要优化反应条件。PCR技术扩增产物长度有限。PCR技术的原理操作及应用第12页PCR技术注意事项预防污染，建立良好质量控制。操作时防止气溶胶产生，尤其注意阳性样品拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最终一步才加核酸，液体分装使用等。引物设计合理Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环镁离子浓度对反应效率影响仪器稳定性，升降温速率，管子密合度等RT-PCR注意预防RNA降解PCR技术的原理操作及应用第13页PCR技术操作1以流感病毒RT-PCR和Real-timeRT-PCR检测为例说明PCR技术操作步骤主要仪器：PCR仪，Real-timePCR仪，微量移液器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。PCR技术的原理操作及应用第14页PCR技术操作21.病毒核酸RNA提取2.RT-PCR反应或者Real-timeRT-PCR反应3.UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果PCR技术的原理操作及应用第15页流感病毒核酸提取1试验材料QIAGEN企业RneasyMiniKit

(或QIAGEN企业QIAmpViralRNAMiniKit，操作类似)β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）70%乙醇无菌及DNA,RNA酶1.5ml离心管10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头可调13K微型冷冻离心机待检流感病毒200μlPCR技术的原理操作及应用第16页流感病毒核酸提取21、取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）200ul加在1.5mlEppendorf管中2、依次加入350ulRLT液、3.5ulβ-巯基乙醇和70%乙醇550ul混匀3、将Rneasyminispin柱子置于洁净2ml搜集管上，将2步骤混合液600ul吸出加入柱子中，12，000rpm，离心15秒，弃搜集管中离心液4、柱子仍放回搜集管上，将2步骤剩下混合液全部吸到柱子上，12，000rpm，离心15秒，弃离心液5、于柱子中加入700ulWashBufferRW1液，12，000rpm，离心15秒6、取一支洁净2ml搜集管，将离心后柱子移到新搜集管上，于柱子中加入500ulWashBufferRPE液，12，000rpm，离心15秒

7、弃搜集管中离心液，再于柱子中加入500ulWashBufferRPE液，13，000-14，000rpm，离心2分钟

8、将柱子移到一洁净1.5mleppendrof管上，于柱子中加入20-50ulRnase-freeWater，室温静置1-3分钟

9、12，000rpm，离心1分钟，搜集离心液即为提取病毒RNA，马上做试验或-20℃以下保留试剂盒为QIAGEN企业RNeasyMiniKit（catalog#74104）注意：试剂盒中RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积到达55ml。PCR技术的原理操作及应用第17页RT-PCR反应1试验材料QIAGENOneStepRT-PCRKit（CatNo210212）RNaseinhibitor40u/μl上游引物200ng/μl下游引物200ng/μl扩增H5亚型禽流感病毒引物序列为：H5-1:5’-GCCATTCCACAACATACACCC-3’，H5-3:5’-CTCCCCTGCTCATTGCTATG-3’提取RNAPCR技术的原理操作及应用第18页RT-PCR反应21、分别标识好0.2ml微量离心管。在每个管中加入以下内容：

5ulQIAGENOneStepRT-PCRbuffer，5×1ul10mMdNTPs1ulEnzymeMix0.13ulRNaseinhibitor(40U/ul)14.3ulRnase-freewater

2、加1ul引物加5ul未知RNA或5ul阳性对照或Rnase-freewater作为阴性对照。PCR技术的原理操作及应用第19页RT-PCR反应3

OneStepRT-PCR反应条件以下：

50℃作用30分钟（逆转录：RNA

cDNA）

95℃作用15分钟（使逆转录酶等失活）

94℃变性30秒

55℃退火30秒

72℃延伸30秒回到第3步，34个循环

72℃作用2分钟结束PCR技术的原理操作及应用第20页RT-PCR扩增产物检测1凝胶电泳缓冲液配方10×TBE缓冲液(每升)：Tris107.8gBoricAcid55.0gEDTA(Na2)8.2g10×TAE缓冲液(每升)：Tris48.4g冰乙酸11.42g0.5mol/LEDTA20ml用电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，按每孔8ulPCR产物上样至胶中。100伏电泳30min，紫外观察并拍照统计。PCR技术的原理操作及应用第21页RT-PCR扩增产物检测2RT-PCR扩增产物检测及结果判定PCR技术的原理操作及应用第22页Real-timeRT-PCR操作1病毒核酸RNA提取：同RT-PCR

Real-timeRT-PCR：以匹基企业禽流感检测试剂盒为例，按试剂盒操作说明，25μl反应体系：RT-PCR反应液15μl，Taq酶0.25μl，逆转录酶n/4颗（n为PCR管数），待检RNA10μl，加好RNA后400g离心5sec，将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，统计样本摆放次序。反应条件为：42℃30min；92℃3min；92℃10sec,45℃30sec72℃1min5个循环；92℃10sec,60℃30sec40个循环，60℃时设置搜集荧光。PCR技术的原理操作及应用第23页Real-timeRT-PCR操作2结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定标准以阈值线刚好超出正常阴性对照品扩增曲线最高点，结果显示阴性为准；或可依据仪器噪音情况进行调整。CT(Cyclethreshold)值表示每个PCR反应管内荧光信号抵达设定域值时所经历循环数。研究表明，各模板CT值与该模板起始拷贝数对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数对数，纵坐标代表CT值。所以，只要取得未知样品CT值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。基线（Baseline）是指在PCR扩增反应最初数个循环里，荧光信号改变不大，靠近一条直线，这么直线即基线。光阈值threshold设定普通将PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差10倍，荧光域值设定在PCR扩增指数期。PCR技术的原理操作及应用第24页Real-timePCR操作3结果判定1、质控标准1.1阴性对照检测结果为阴性。1.2阳性对照Ct值应小于等于28.0。不然，此次试验视为无效。2、结果判断2.1Ct值无数值样本为阴性样本。2.2Ct值≤30.0样本为阳性。2.3Ct值大于30.0样本提议重做。重做结果无数值者为阴性，不然为阳性。PCR技术的原理操作及应用第25页PCR技术应用基因克隆、测序和表示等法医学个体识别和亲子判定遗传性疾病检测、肿瘤诊疗、病原体检测等PCR技术的原理操作及应用第26页基因克隆和表示PCR技术的原理操作及应用第27页DNA指纹技术11984年英国遗传学家AlecJeffreys在进行肌红蛋白DNA序列研究时，意外发觉非功效DNA（不产生蛋白DNA）上重复着一个小片段DNA，这一含15个左右碱基DNA片段，在不一样个体间重复频率及位置有显著不一样，Jeffreys首先在自己DNA上进行研究，验证了这一技术，假如我们有血缘关系，这些不一样会大大缩小。Jeffreys命名这一技术为DNA指纹技术（DNAfingerprint）。PCR技术的原理操作及应用第28页DNA指纹技术2采集血样（毛发、精液、口腔粘膜细胞），分离DNA，用PCR将选定DNA片段放大，并进行对比，统计分析，便可得出是否为作案凶手或是否有血缘关系。PCR技术的原理操作及应用第29页分子诊疗学分子诊疗学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系存在、结构或表示调控改变，为