分子生物学实验复习题

分子生物学实验复习题实验中为什么选用RNA而非DNA作为模板调取目的基因？因为真核生物，DNA出了含有编码序列外还含有非编码序列（内含子），而我们只需目的基因这段序列。RNA是经过加工的，没有内含子，通过提取高质量的RNA再进行逆转录即可得到不含内含子的cDNA，即所需的目的基因。RNA提取过程中的注意事项有哪些？（1）所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗涤。（2）全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套。（3）配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌。逆转录反应，有哪几种引物可用？如何进行选择？（1）引物：OligodT：①长度适宜，一般为15~30个碱基；G+C含量，一般为40%~60%；②4种碱基应随机分布；③引物自身不应存在互补序列；④2个引物之间不应有多于4个碱基的互补；⑤引物3′端不应有任何修饰；⑥引物5′端可以修饰简述用氯化钙方法制备感受态细胞转化原理？（1）正在生长的大肠杆菌在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）。（2）感受态细胞与外源质粒DNA形成一种粘着在细胞表面上的队DNAase抗性的羧基钙磷酸复合物。（3）42℃下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。（4）进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。（5）将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。转化过程中要注意哪些因素细胞生长状态和密度、质粒的质量和浓度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染简述质粒DNA提取原理在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性，但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，二质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。请列举4种阳性克隆的筛选方法和鉴定方法（一）采用遗传学方法可筛选特定的重组体DNA1.利用抗性标记可筛选出带有载体的细菌克隆2.利用不同标记可筛选出带有重组体的细菌克隆①插入灭活法利用特定抗性基因的失活进行筛选②α-互补筛选是利用功能互补的基因片段（二）核酸杂交法适合从文库中筛选特定的DNA（三）PCR技术可对特定的DNA进行直接鉴定（四）酶切鉴定是利用限制酶酶切图谱鉴定特定的DNA简单谈一下如何选定酶切鉴定时所用的酶限制性内切酶的选用必须根据载体和插入片段上酶切微点来确定。酶切鉴定是必须的，基于下述：限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱一样。统一载体连接不同的DNA片段，不同的载体连接统一片段（片段上也有位点）酶切图谱是不同的。插入法（单酶单切点）或替代法（双酶双位点）酶切，一般来说用3种限制酶切：可鉴定载体及插入片段的大小、方向、切后并电泳分析，以确定是否得到预期的rDNA。简述克隆大鼠的GAPDH基因的主要步骤①TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNA②核酸的定量③电泳检测④PCR产物4℃保存或琼脂糖凝胶电泳检测⑤从琼脂糖凝胶中分离回收PCR产物⑥6GAPDH基因的TA克隆、连接、转化Trizo:是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA的完整性。荧光定量PCR中，请说明阈、基线、Ct值的概念。Baseline（基线）：在PCR开始几个循环内所发散的荧光信号，这段时间内定量PCR仪器还未能检测到PCR产物的扩增，缺省设置为3-15个循环的荧光信号（背景荧光信号）。Threshold（阈值）：用来确定Ct的荧光强度。是在荧光扩增曲线上认为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段在任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值：到达阈值荧光信号所需要的循环数。在做荧光定量PCR实验时要注意些什么？(1)在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性转移器吸头（带滤嘴自卸式），不能用手直接接触毛细管、离心管的底部。(2)操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。(3)配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反映体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。影响质粒转染效率的因素有哪些？转化率：转化效率/细胞总数影响因素：（1）载体：载体的性质、空间结构、分子大小等（2）受体细胞（3）转化过程获得高转化率的关键：感受态细菌的制备。脂质体转染实验中，请说明脂质体接到转染的原理脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的，在水中可以自动生成闭合的双层膜，最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体。现商品化的脂质体通常是阳离子脂类和中性脂类的复合体。其中以阳离子脂类起主要作用，阳离子脂质体既能与DNA可以通过静电作用形成脂-DNA复合物，也能被表面带负电荷的细胞膜媳妇，从而引导DNA进入细胞。中性脂类可促进胞内释放DNA。请简述荧光素酶报告基因简单的实验流程。（1）构建载体：把调控序列插入到含有萤火虫荧光素酶（Lue）或海参荧光素酶（Rlue）的载体中。（2）转染（3）提供刺激（4）检测荧光16.RT-PCRRNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA.用途:获得所需cDNA片段；检测基因表达注意问题：（1）PCR效率差异，重复性（2）内参选定（3）mRNA丰度逆转录：RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物:OligodT)PCR:cDNA、缓冲液、dNTP、rTaq、引物（特异引物)、Mg2+17.胶回收原理：回收柱（硅胶膜）在高盐、低PH值的情况下吸附DNA，在低盐、高PH值的情况下释放DNA。影响胶回收的几个影响因素，PH值、高盐试剂、低盐洗脱试剂。18.转化(Transformation)：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。脂质体转染实验与荧光素酶活性检测一、什么是报告基因？所谓的报告基因（reportergene）,是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。该基因的表达与插入基因的表达有关。该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检测。二、理想的报告基因：1.内源性低2.细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因的检测3.报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高并且重复性好三、荧光素酶报告基因载体常用的萤光素酶报告基因载体：萤火虫萤光素酶报告基因载体、海肾萤光素酶报告基因载体、pGL2,pGL3,pGL4萤火虫荧光素酶报告基因：萤火虫luc以其高度的灵敏性和很宽的线性范围而成为哺乳动物细胞中使用最多的报告基因。本次所用载体：promega公司的pGL3-promoter所用质粒：pGL3-promoter-ERE(雌激素应答元件）与配体结合的ER发生构型改变，被激活形成二聚体，激活的ER二聚体与雌激素应答元件(estrogenresponseelement,ERE)结合，ER-ERE复合物促使转录起始复合物形成并诱导转录。四、荧光素酶报告基因简单实验流程：1、构建载体把调控序列连入到含有萤火虫萤光素酶（luc）或海肾萤光素酶（Rluc）的载体中2、转染3、提供刺激4、检测荧光五、转染原理：1.脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的。在水中可以自动生成闭合的双层膜，最初,人们只是运用脂质体模拟生物膜,研究膜的构造及功能,从而发现了膜的融合及内吞作用,因而可用作外源物质进入细胞的载体。2.现商品化的脂质体通常都