骨髓间充质干细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

1、骨髓间充质干细胞别离培养及在移植肝中定居才能的研究【摘要】目的体外别离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞(S)，观察S在肝移植受体内的定居才能。方法直接贴壁法培养大鼠S，绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞外表标志。定向诱导S向成骨和成脂肪分化，鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记S，由门静脉注入肝移植受体，取肝组织冰冻切片，观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功别离培养S，并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5d，可在体外传代20代以上，具有强大的增殖才能。流式细胞仪检测符合S表型。S可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞，具有多向分化的才能。DAPI标记S的阳性率达100%。荧光显微镜观

2、察，可见S定位于移植肝内。结论直接贴壁法别离培养S简单易行,获得S纯度高，生物学特性稳定;S可以在移植肝内存活并定居。【关键词】别离培养;鉴定;大鼠;肝移植骨髓间充质干细胞(esenhyalsteells,S)是一种成体干细胞，具有高度的增殖才能和多向分化潜能。国内外学者将S应用于急性心肌梗死、脑梗死、肝功能衰竭、大面积烧伤等组织创伤修复上，获得了显著的效果。S具有免疫原性低、自体或异体植入无明显排挤反响、体外转基因效率高的特点，是基因工程的良好载体。笔者对S进展别离培养及表型鉴定，并观察其在同种异体肝移植受体内的定居情况。1材料与方法1.3S生长曲线绘制取第3代细胞，以1104L-1细胞悬液

3、分别接种于24孔培养板中培养，每孔1L。每日取出3孔，连续7d，消化后细胞计数，绘制生长曲线。1.4流式细胞仪检测S外表标志取第3代S，接近90%交融时，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，1000r/in离心5in，取1106细胞悬于100LPBS中。分别参加D34、D44、D45、D90、D11b抗体至饱和浓度，室温避光反响30in，PBS洗涤，以FBuffer固定细胞，流式细胞仪进展检测。2结果2.1S别离培养扩增采用直接贴壁法培养S，24h左右大局部细胞获得贴壁，贴壁细胞为圆形、梭形或多角型。48h通过换液去除未贴壁的杂质细胞，可见细胞形态较为均一，圆形或短梭形，折光性好。3d后细胞增殖

4、加快，开场呈平行、放射状或漩涡式集落样生长，逐渐连接成片，铺满瓶底，79d可以到达80%90%交融，观察细胞形态均一，长梭形，呈成纤维细胞样。传代后细胞生长更为旺盛，很快贴壁，均匀分布生长，约56d长满培养瓶底，细胞排列有序。传代周期约5d左右。S通过不断传代得以纯化(图1)。但在20代以后，细胞生长逐渐缓慢，宽大扁平，开场老化。2.2细胞生长曲线传代后的S在经过12d左右生长缓慢的埋伏期，进入对数生长期，细胞快速增殖，第5天以后进入平台期，细胞生长变慢或不再增殖(图2)。2.3细胞外表标志物将第3代S利用流式细胞仪检测细胞外表标志物，结果发现D44、D90分别为94.81%，99.53%，呈

5、阳性高表达。而D34、D45、D11b分别为0.04%，1.94%，1.42%，呈阴性表达，符合S外表标志特征。2.4成脂成骨分化实验成骨诱导培养3d，细胞体积增大，呈短梭形;诱导第7天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多;第14天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间钙质沉积;第21天，细胞结节中心的细胞逐渐交融失去细胞构造，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节。成脂诱导72h后，细胞内有小脂滴出现，约2周后脂滴数量增加并互相交融，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红染色显示有大量脂质沉淀，可见红色深染的大量脂滴，说明脂肪细胞生成(图3)。2.5移植肝内S分布情况DAPI标记30in后，荧

6、光显微镜下可见所有的S细胞核均标记上蓝色荧光，标记率达100%(图4)。在移植肝内有大量的蓝色荧光标记的细胞，分布较广，呈散在片状。除在肺脏可见少量荧光标记的S，在心脏、肾脏均未见荧光(图5)。3讨论目前虽然已从多种组织中培养出间充质干细胞，但因为骨髓的取材较方便，别离培养简便及含量相对较高，因此骨髓成为间充质干细胞的主要来源7。在不同诱导因素的作用下，S可向不同的谱系分化。在实验中，笔者改变了S的培养环境，在不同的诱导介质条件下S实现了向成脂细胞和成骨细胞的分化，显示了所获取培养的细胞具有多向分化的才能，证实其为S。DAPI是一种标记细胞核的新型荧光染料，专一性强、灵敏度高、稳定性好，对活细胞无毒性，荧光保持时间较长，操作简便，可以直接观察，因此被作为标记细胞的一种有效手段13。笔者将S用DAPI进展染色标记，发现标记成功率近100%，在荧光显微镜下激发波长358n条件下可见细胞核发出蓝色的荧光。不管是细胞培养还是在体肝组织内标记，1月内均可检测出强烈的蓝色荧光。笔者发现，通过门静脉移植S操作简便，细胞损失较小，除在肺脏发现少量的S，绝大局部S均拘留在肝脏内。在肝移植完毕，门静脉充分暴露的情况下，可以很容