基因工程的工具酶ppt课件

本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 Date1欢迎同学们听课！ 第二章 基因工程的工具酶 2.1 核酸酶 2.2 甲基化酶 2.3 连接酶 2.4 聚合酶 2.5 修饰酶 Date2欢迎同学们听课！ 2.1 核酸酶 限制性核酸内切酶 2.1.1 限制性核酸内切酶的类型 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法 2.1.3 限制性内切酶的识别序列 2.1.4 限制性内切酶的切割位点 2.1.5 限制性内切酶的切割方式 2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系 2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性 2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 2.1.9 限制性核酸内切酶酶切注意事项 Date3欢迎同学们听课！ 几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包 括许多病毒。 酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布 、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件 的改变而改变。 Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋 白质。 定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样 催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子， 包括蛋白质和核酸等。 Date4欢迎同学们听课！ 限制性内切酶（Endonucleosase）的发现 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专 一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所 感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊 的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制 修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修 饰分子机理： hsd R-限制性内切酶 hsd M-限制性甲基化酶 hsd S-控制两个系统的表达 Date5欢迎同学们听课！ 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离 出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为 基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类 酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约 有100种，而实验室常用的有20种 。 Date6欢迎同学们听课！ III类：识别位点严格专一（不是回文序列）， 但切点不专一，往往不在识别位点内部。 2个亚基组成： Hsd M甲基化 Hsd R限制性内切酶功能 需要ATP、Mg2+，类似于 I 应用同样受限制。 Date9欢迎同学们听课！ II类：识别位点（回文序列）严格专一，并在 识别位点内将双链切断。因此在基因工程中具 有实用价值的是II类限制性内切酶。 应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件 具有两个亚基： Hsd M甲基化 Hsd R限制性内切酶功能 切割特异 Date10欢迎同学们听课！ 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母 斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株（型）的代号 命名。该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马 字母编号I, II, III等。如：Escherichia coli 用Eco表示。 第四个字母代表菌株或株型、变种名，若酶存在于质粒 上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。例：Hind III 从流感嗜血菌株（Haemophilus Influenzue）d 株中 分离的第三个酶。EcoR I 表示基因位于Escherichia coli 中的抗药性R质粒上。 Date11欢迎同学们听课！ derivation： first three names from the latin names of the microorganism that produces them. first letter(genus), next two letters(species) writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。 如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌 株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字,表 示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。 Date12欢迎同学们听课！ 2.1.3 限制性内切酶的识别序列 识别序列 指限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊 核苷酸序列 专一 通常46个特定的核苷酸对组成 迴文结构(palindromic sequence) 或旋转对称或二重互 补对称 Date13欢迎同学们听课！ recognition sequence: cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic (symmetrical) recognition sequences to leave a 5- phosphate and a 3-OH. They leave blunt ends, or protruding 5- or 3-termini. EcoR: * 5G A A T T C 3 3C T T A A G 5 * Date14欢迎同学们听课！ recognition sequence enzymes 5 GTT AAC 3 Hpa blunt end 3 CAATTG 5 5 GAATTC 3 EcoR 5protruding end 3 CTTAAG 5 5 AAGCTT 3 Hind 5protruding end 3 TTCGAA 5 5 GGATCC 3 BamH 5protruding end 3 CCTAGG 5 5 CTGCAG 3 Pst 3protruding end 3 GACGTC 5 Date15欢迎同学们听课！ 识别序列在DNA上出现的概率 1/4n（n识别序列核苷酸组成的数目） Sau3A 4 碱基酶, 则每隔256(44) bp会出现一个识别位点 。 EcoR I、Pst I 6碱基酶，则每隔4096 (46) bp会出现一 个识别位点。 Not I (8bp)= 1/48 65536，稀切酶 （rar cutters）: 指识别序列长和识别序列富含GC或富含AT的限制性核 酸内切酶。 仅是理论推测 Date16欢迎同学们听课！ 同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的 限制酶可切割同一靶序列BamH I 和Bst I具有相 同的识别序列GGATGC 同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同 ，但产生相同粘性末端的酶。两个同尾酶形成 的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能 够再被其任何一种同尾酶识别。如： BamH I 识别序列：GGATCC Bgl II 识别序列： AGATCT Date17欢迎同学们听课！ 远距离裂解酶(distant cleavage)：识别位点与切 割位置不一致。如： Faq I GGGAC (10/14) 5-GGGACNNNNNNNNNNNNNNNN-3 3-CCCTGNNNNNNNNNNNNNNNN-3 可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可 变的。如：BseJ I GATNNNNATC Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的 识别序列之中。如：Ehe I GGCGCC Hin6I GC GC Date18欢迎同学们听课！ 2.1.4 限制性内切酶的切割位点 切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下， 两条链断开的位置。 一般在识别序列的内部或两侧附近。 以或 表示。 环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点 ，完全切割得到n个DNA片段。 线性DNA分子，则会得到n+1个DNA片段。 Date19欢迎同学们听课！ Restriction digests digestion of plasmid or genomic DNA,for analytical or preparative purposes, using commercial enzymes and buffer solutions. All RE require Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,NaCl concentrations or other solution constituents for optimum activity. Date20欢迎同学们听课！ 2.1.5 限制性内切酶的切割方式 交错切割（staggered cut）: DNA双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位 置的两侧，使切割后的DNA末端为单链突出的黏性末端 。如：BamH I -GGATG C- -C CTACG- 平切割： DNA双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使 切割后的DNA末端为平齐的平末端。 如：Nsb I TGC GCA Date21欢迎同学们听课！ 粘性末端 和平末端 粘性末端 (cohesive terminus/sticky ends)： DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个 具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样 的DNA末端，称为粘性末端。 3粘性末端： 3 突出的黏性末端（DNA末端的3端 比5 长） 5 粘性末端： 5 突出的黏性末端（DNA末端的5端 比3 长） 平末端（blunt ends）： DNA片段的末端是平齐的 。 Date22欢迎同学们听课！ 同尾酶（isocaudamer） 指来源不同，识别序列不同，但可以产生相同 黏性末端的限制性内切酶。 两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情 况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别 。如： BamH I 识别序列：GGATCC Bgl II 识别序列： AGATCT Date23欢迎同学们听课！ 2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系 2.1.6.1 底物DNA 2.1.6.2 酶量 2.1.6.3 反应缓冲液 2.1.6.4 反应温度 Date24欢迎同学们听课！ 2.1.6.1 底物DNA 进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA 。一般来说，要用 2 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。 酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结 果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。 进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA 。一般来说，要用 2 3 倍 才能保证完全消化，对基因 组 DNA 尤其如此。 酶切基 因组 DNA 是否完全可通过 紫外观察结果来判断，如看 到 DNA 片段呈均一递减的 一条区带，则表示酶切完全 。 水稻基因组的EcoR I酶切 Date25欢迎同学们听课！ 2.1.6.2 酶量 根据酶的活性和DNA底物的量而定。 限制性核酸内切酶活性单位定义： 在酶的最适反应条件下，在50l容积中 ，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量 为1个酶活性单位（unit 或U） 与DNA分子上识别位点的密度有关： 密度大用酶量多；密度小用酶量少。 Date26欢迎同学们听课！ 2.1.6.3 反应缓冲液 Tris-HCl or Tris-HAc MgCl2 or MgAc2 KAc or NaCl 二硫基苏糖醇(DTT) or -巯基乙醇(ME) 牛血清白蛋白(BSA) pH 7.58.0 at 37C Date27欢迎同学们听课！ 2.1.6.4 反应温度和时间 大多数限制酶的反应温度为370C。 个别特殊的内切酶则需要在300C 、500C、600C 或650C的温度下进行切割。 反应时间：一般在适宜的缓冲液和温度条件下， 每微克DNA用15单位的酶，保温12小时。 Date28欢迎同学们听课！ 2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性 星活性（star activity）： 指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别 序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现 非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I* Date29欢迎同学们听课！ 引起星活性的原因：若使用buffer不當, 會有star activity，而star activity是指限制酶對所作用的DNA及 序列失去專一性, 當酶辨認切割位置的能力降低，導致 相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產 生錯誤的結果。所以當DNA同時以兩種限制酶處理時 ，選擇可使兩種酶之活性反應均可達75 以上的 restriction buffer，若找不到適當的buffer則先加低盐 的buffer使其中一酶作用後，在加入高盐buffer使另一 酶作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的buffer，則 先加入一種buffer作用後，加3M NaOAc/95 alcohol 沉澱DNA，再加另一種buffer作用。 Date30欢迎同学们听课！ 2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 单酶切: 加单一酶 双酶切:加两种酶 部分酶切: 一般通过控制酶切时间, 使DNA部 分酶切 底物位点优势效应: 酶对同一个DNA底物 上的不同酶切位点的切割速率不同 Date31欢迎同学们听课！ 2.1.9 酶切注意事项 选择正确的酶 DNA的纯度和浓度 反应体系甘油的量5%（酶保存在50甘油中，故所加酶液体积 最多为酶切反应总体积的1/10）。 酶保存在200C；使用时在冰浴上操作。 反应体系各成分都加完后，再加酶。 每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。 酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。 防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。 Date32欢迎同学们听课！ 2.2 甲基化酶 在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。 （一）大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5GATC3序列中的腺嘌呤N6 位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有 5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的 DNA如Bcl I（TGATCA），但BamH I（GGATAA） 则不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶 对底物的特异性不同。 dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或 5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限 制性内切酶是EcoR II。 Date33欢迎同学们听课！ （二） 甲基化酶在基因工程中用途 许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲 基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三 位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切 割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（ SAM）的甲基转移到EcoR I识别顺序中的第三 位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoR I的切割。 Date34欢迎同学们听课！ 2.3 DNA连接酶 (DNA ligase) 2.3.1 E. coli 和T4 DNA连接酶 2.3.2 DNA片段之间的连接 2.3.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接 2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接 2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接 2.3.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接 Date35欢迎同学们听课！ 2.3.1 DNA连接酶（DNA ligase） 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，催化双链 DNA片段紧靠在一起的3羟基末端和5 磷酸基 团末端之间形成磷酸二酯键。 用途：具有修复单链或双链的能力,在 DNA重组、复制和损伤后的修复中都起 关键作用。 提取：许多原核和真核生物及病毒中。 Date36欢迎同学们听课！ E. coli DNA ligase和T4 DNA连接酶 E.coli DNA ligase: Mr=74000, 作用于5端带磷酸基团的DNA底物 NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。 Date37欢迎同学们听课！ T4 DNA ligase: 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。日常 用的最多。 T4 RNA ligase: 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途是对RNA进行3末端标记 Date38欢迎同学们听课！ 2.3.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接 一般较好连接，直接加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。 Date39欢迎同学们听课！ 2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接 连接效率较粘性末端低，尽量避免采用 。加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完 成。 Date40欢迎同学们听课！ affecting factors T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以 下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37, 因 此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温 度的折衷。经常采用12.5（4-15）。 DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA 浓度高10-20倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 time：O/N better Date41欢迎同学们听课！ 2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接 DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾 法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端 分别加上AAA，另一端加上TTT。 粘性末端修饰成平末端后进行连接：一端是粘端，另 一端是平端。 DNA片段5端脱磷酸化作用后连接：防止自身连接环 化。 Date42欢迎同学们听课！ 2.3.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接 连杆/衔接物（linker）：化学合成的812个核苷酸组 成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种 或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一 定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片 段连接。 衔接头/接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有 一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端 具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 都具平末端的两种DNA片段的加连杆的连接 分别具平末端和粘性末端的两种DNA片段的加连杆的连 接 分别具非互补粘性末端的两种DNA片段加连杆的连接 Date43欢迎同学们听课！ 2.4 聚合酶 2.4.1 DNA聚合酶 2.4.2 反转录酶 2.4.3 RNA 聚合酶 Date44欢迎同学们听课！ 2.4.1 DNA聚合酶 (DNA polymerase) E.coli （全酶） DNA聚合酶I Klenow片段T7 DNA聚合酶Taq DNA 聚合酶 性 质质 53聚合酶 35外切酶 53外切酶 53聚合酶 35外切酶 无小亚亚基活性 53聚合酶 35外切酶 聚合速度和持 续续合成能力强 53聚合酶 耐高温 持续续合成能力高 用 途 缺口翻译译法合 成放射性标记标记 的探针针 使粘性末端转转 换为换为 平末端 随机引物法合成 放射性标记标记 探针针 修补补3隐隐蔽的粘 性末端为为平末端 DNA 3末端标标 记记 cDNA第二链链的 合成 测测序酶 DNA 3末端标标 记记 使粘性末端转转 换为换为 平末端 PCR Date45欢迎同学们听课！ 2.4.2 反转录酶 (reverse transcriptase) 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase） 最常见的商用反转录酶：来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒 （avian myeloblastosis virus, AMV）。 AMV反转录酶具有反转录酶活性和RNaseH活性 反转录酶活性可以单链RNA或DNA为模板，以寡聚脱 氧胸腺嘧啶核苷olig(dT)或随机寡聚脱氧核苷酸为引物 合成同模板序列互补的互补链。但DNA指导的DNA聚 合酶特性，不具有35外切酶活性，聚合时无校正功 能。 RNaseH具有核酸外切酶活性，能以53或35方向 特异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。 最主要的用途：以mRNA为模板合成cDNA。 Date46欢迎同学们听课！ 2.4.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须有 启动子。 常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。 用途：RNA探针的合成。 Date47欢迎同学们听课！ 2.5 修饰酶 末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl trasnferase/terminal transferase)：不依赖于DNA 的DNA聚合酶，来自于小牛胸腺组织，在DNA分 子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。 T4多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinase) (next page) 碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase):(next page) Topoisomerase改变