小鼠体内多肽k

小鼠体内多肽k

肿瘤的持续生长和入侵转移与肿瘤新血管的形成密切相关。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是作用最强的促血管生成因子,通过与血管内皮细胞上的特异性受体-2(VEGFR-2,又称KDR)结合促进内皮细胞增殖、迁移,引发新生血管生成。KDR主要表达于肿瘤血管内皮细胞和胚胎血管内皮细胞。从噬菌体多肽库中筛选而获得的12肽K237,可高亲和力特异性结合KDR,阻断VEGF与KDR的结合,阻止新生血管生成,切断肿瘤营养,达到治疗肿瘤的目的。本研究采用99mTc直接标记人工合成的多肽K237,探讨99mTc-K237的最佳标记条件及其在动物体内的分布。1材料和方法1.1实验动物与仪器清洁级昆明小鼠及BALB/c裸鼠购于第二军医大学实验动物中心;K237委托上海华大天源生物科技有限公司合成;SnCl2·2H2O由Merck公司生产;99mTcO-4洗脱液由上海欣科医药公司提供;人奇静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)引自美国培养物保藏中心(ATCC)。实验仪器:SN-695B型智能放免γ测量仪(上海原子核研究所日环仪器一厂);FA2104N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);Delta320pH计(上海梅特勒-托利多公司);FG-391A2型微机活度计(北京核仪器厂);高效液相色谱仪(HPLC,岛津公司);BSZ-100自动收集仪(上海精科实业有限公司)。1.29snpl22h2o及k3采用直接标记法,对影响标记结果的5个重要因素分别选取不同的水平:SnCl2·2H2O用量20～160μg;K237用量40～140μg;反应体系的pH值2.0～11.0;反应温度4～37℃;反应时间10～30min。1.3mtc-纳米金属的rf采用纸层析法,在2种展开体系中进行分析。体系1采用新华1号层析纸作为固定相,以丙酮为展开剂,99mTc-K237及胶体的Rf=0,99mTcO-4的Rf=0.7～0.9;体系2以质量分数2.5%牛人血白蛋白浸泡过的新华1号层析纸作为固定相,以V(乙醇)∶V(氨水)∶V(水)=2∶1∶5作为展开剂,99mTc-胶体Rf=0,99mTc-K237及99mTcO-4的Rf=0.7～0.9。1.4k3的吸光度LC-6AD泵;VenusiMRC-ODSC18柱(4.6×250mm),柱温25℃;流动相A液为质量分数0.1%的三氟乙酸,B液为含质量分数0.1%三氟乙酸的乙腈;99mTc-K237进样量50μl,泵流速1.0ml/min;K237标准品和99mTc-K237在214nm处吸光度(A)值最高。用自动部分收集仪收集99mTc-K237洗脱液(每管1ml),流速1ml/min,并测量各管放射性计数,得出洗脱曲线。1.5样品的采集和放化纯的测定取10管200μl的99mTc-K237混悬液,分为2组,用2倍体积的生理盐水和正常人血清稀释,分别于室温和37℃条件下保存24h,并于1、2、6、12及24h取少量样品测定放化纯。1.6特异性细胞结合率HUVEC用含10%新生小牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数5%CO2的培养箱中常规培养传代。待细胞繁殖至对数生长期,制成细胞数分别为1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011个/L的细胞悬液,各取60μl加入离心管,设3支复管,再加入20μl(5.55kBq)标记物。在37℃细胞培养箱中温育1h后,测各管总放射性计数(T)。4℃离心(离心半径12cm,2000r/min,5min)后去上清,用PBS(0.01mol/L,pH值7.4)洗涤2次,再测结合在细胞上的放射性计数(B)。同时做非特异性结合实验,方法同上,不同的是在各管细胞中先加入50μg未标记的K237,再加入等量标记物。特异性细胞结合率(%)=总细胞结合率(B/T)均数-非特异性细胞结合率均数。99mTcO-4的细胞结合率测定:在细胞悬液中加入20μl(5.55kBq)99mTcO-4洗脱液,其余步骤同上。1.7各组患者单次给药及密度健康雄性昆明小鼠30只,4～6周龄,体重19～21g,随机数字表法随机分为6组,每组5只。尾静脉注射2.96MBq(0.1ml)99mTc-K237,分别于注射后30min和1、2、4、8及24h各处死一组小鼠,取血液及其他主要脏器,称重并测定放射性计数,经放射性衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率(%ID/g)。1.8大鼠《针》的生长人肺癌A549细胞于37℃、体积分数5%CO2、质量分数10%新生小牛血清的DMEM培养基中常规培养传代。取4～5周龄BALB/c裸鼠3只,体重19～21g,于右前肢腋下接种A549细胞2×106/只,并饲养于无特殊病原体级动物房,待肿瘤直径达1.0cm左右时用于显像。经尾静脉注射99mTc-K2375.55MBq/只(0.2ml),注射后1、2、3、5及8h行SPECT显像,观察显像剂在肿瘤灶的浓聚情况,用感兴趣区(regionofinterest,ROI)技术计算肿瘤/对侧正常组织(T/NT)的放射性计数比值。1.9均数统计学处理应用SASV8.1统计软件,计量资料以±s表示,两样本均数比较采用t检验,多组均数比较行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.19标记条件的确定SnCl2·2H2O用量100μg、K237用量100μg、pH值6.0、反应时间10～30min及室温反应温度为99mTc-K237的最佳标记条件,该条件下可得到标记率>95%的99mTc-K237。2.2标准物质和纯度的注入最佳标记条件下,99mTc-K237的标记率和放化纯均>95%。纸层析测得胶体和99mTcO—4为1.92%～2.44%。2.3主发射峰值时间K237标准品和99mTc-K237的保留时间分别为15.4和15.7min。99mTc-K237的HPLC洗脱曲线表明主放射峰值时间均约为15min;约24和27min处各有一小放射峰,共占总放射性计数的2.15%。2.49放置24h后,其放化纯2组99mTc-K237在生理盐水和正常人血清中放置24h后,其放化纯分别为(89.14±1.42)%和(88.33±1.12)%,二者差异无统计学意义(t=1.56,P>0.05)。2.5非特异性细胞结合率99mTc-K237的总细胞结合率最高为(44.18±3.11)%,非特异性细胞结合率最高为(3.82±0.26)%,特异性细胞结合率最高为40.36%;99mTcO—4的细胞结合率最高为(2.87±0.43)%,表明标记产物具有较好的生物学活性与特异性(表1)。2.69肾放射性下降99mTc-K237在小鼠血液中清除迅速,2h时放射性仅为30min时的18.66%;通过肾脏排泄较快,30min时肾放射性高达142.44%ID/g,2h时下降了53%;胃及甲状腺的放射性始终处于低水平;心、肺、肝、脾、小肠及肌肉放射性随时间逐渐下降;4h后除肾的放射性较高,其余各组织放射性呈低水平(表2)。2.7其他器官的观察荷瘤鼠尾静脉注射99mTc-K2371h后,即可见肿瘤部位有放射性浓聚,随时间延长,3h肿瘤显像最清晰。肾脏和膀胱有较高的放射性分布,其余器官如脑、肺、肝、小肠及肌肉等无明显放射性浓聚,未见甲状腺及胃显像(图1)。用ROI技术测得1、2、3、5及8h的T/NT比值分别1.25±0.11、3.13±0.26、3.97±0.31、1.34±0.29和1.18±0.25。3标记物的筛选和生物活性的提高作为肿瘤显像剂,放射性核素标记的多肽或蛋白目前已得到了广泛的研究和应用。小分子多肽的放射性核素标记分直接法和间接法。99mTc直接法标记已成功用于含二硫键的小分子多肽,对于不含二硫键的小分子多肽,存在通过非巯基结合的标记方法。Meléndez-Alafort等采用99mTc直接标记抗菌胜肽ubiquicidin(UBI)29～41片段,其氨基酸序列中虽不含二硫键,但带6个正电荷残基(5Arg+1Lys),发现在高碱环境下,99mTc-UBI的平均放化纯达97%,产物稳定性好,且保留了同等的生物学活性,而Arg和Lys中的氨基是UBI最可能的结合位点。99mTc能直接通过结合组氨酸(His)的咪唑基团而与蛋白质或多肽形成稳定的络合物。有作者在重组抗-癌胚抗原(anti-CEA)单链抗体片段的羧基末端接上6个His作为结合位点,然后采用99mTc直接标记,标记率>95%,标记过程并未造成抗体活性损失,产物具有较高的体内外稳定性。基于上述研究,加之K237的氨基酸序列中虽不含Cys,但含有5个His,故99mTc可能通过结合His中的咪唑基团而与K237形成稳定的络合物。本研究采用99mTc直接标记K237的方法,在最佳标记条件下,得到标记率和放化纯均>95%的标记物,并且具有较好的稳定性和生物活性。标记物经HPLC分析,洗脱液放射峰值时间与紫外检测保留时间基本一致(约15min),表明99mTc已成功标记于K237上。保留时间约24和27min处的小峰为胶体和99mTcO—4,共占总放射性计数的2.15%。纸层析测得胶体和99mTcO—4为1.9%～2.4%,与HPLC洗脱液分析结果具有良好的一致性。分布实验结果表明,99mTc-K237在心脏和脾脏主要呈血池型分布,其浓度随血液本底的清除而下降。标记物在血液中迅速清除,有利于降低本底,增加靶/非靶组织放射性比值。胃和甲状腺的放射性一直处于低水平,表明标记物在体内比较稳定,无明显脱锝现象。对荷瘤小鼠的显像可见99mTc-K237在瘤体部位的高摄取提示99mTc-K237具有较好的体内稳定性,同时保留了较高的生物学活性。放射性核素标记多肽在肿瘤血管生成的显像和治疗研究中被广泛应用。KDR是肿瘤新生血管形成过程中VEGF的主要受体,作为肿瘤血管内皮细胞的特异性分子标识,在人正常的内皮细胞几乎不表达。Lei等从噬菌体12肽库中筛选而获得的12肽K237能与KDR高亲和力结合,竞争性抑制VEGF结合KDR,显著抑制由VEGF刺激而引起的人脐静脉内皮细胞增殖;体内实验表明,DHFR-K237能显著抑制鸡胚尿囊膜血管形成和荷瘤裸鼠中肿瘤的生长。韦华等报道,在对前列腺癌细胞系LNc