第一章 寄生虫抗原

第一章寄生虫抗原及其应用在寄生虫与宿主的相互关系中，寄生虫抗原引起宿主产生免疫应答，特别是那些存在于寄生虫体表或分泌排泄物内的抗原，与宿主的免疫细胞直接接触，具有重要的免疫原性。寄生虫抗原的化学构成：多肽蛋白质糖蛋白脂蛋白多糖核酸科技的发展与寄生虫抗原的应用生物化学的发展使得寄生虫抗原分离纯化技术得到长足的发展；分子生物学技术的应用使得寄生虫抗原成为诊断方法物质基础和疫苗的可能性成为现实。第一节寄生虫抗原的分类寄生虫抗原的分类1982年国际寄生虫学大会，Anderson等提出将寄生虫抗原按以下三个方面进行分类，并得到大会通过。按照免疫学标准分类按照寄生虫学标准分类按照生物学标准分类一、按照免疫学标准分类1.功能性抗原（1）宿主保护性抗原与诱发和表现宿主保护性免疫有关的抗原。（2）免疫诊断抗原与建立相关寄生虫感染的免疫诊断方法有关的抗原，如循环抗原等。（3）免疫病理抗原与诱发和表现寄生虫保护性免疫反映有关的抗原。（4）寄生虫保护性抗原与诱发宿主免疫反应但同时能够对寄生虫产生实际具有保护性质的抗原。2.按照在不同宿主的免疫原性进行分类（1）自然抗原使宿主在自然感染的情况下或者对自然宿主进行免疫接种时使宿主机体产生免疫反应的抗原。（2）新抗原又称为异源抗原，非自然宿主的免疫接种和非相容性宿主的免疫接种用抗原。3.半抗原在一定环境条件下寄生虫产生的载体决定簇，主要引起细胞免疫的非正常活动。如：刺激T淋巴细胞的载体决定簇，刺激B淋巴细胞的半抗原决定簇，刺激抑制性T淋巴细胞的决定簇。二、按寄生虫学标准分类1.来源和定位（1）可溶性外抗原从活的寄生虫、被寄生的细胞或培养的寄生虫释放的抗原。（2）可溶性体抗原自寄生虫或被寄生虫寄生的细胞浸出的表面或内部抗原。成虫浸出液幼虫体抗原感染细胞表面抗原（3）虫体抗原死寄生虫寄生虫碎片寄生虫分泌泡生活的全虫寄生虫体腔液寄生虫特殊器官分泌液体绦虫幼虫的囊液等。2.按照虫群的生活史分类（1）虫特异性抗原属特异性抗原种特异性抗原株特异性抗原期特异性抗原蜕皮抗原三、按生物学标准进行分类1.按照组成成分蛋白质脂肪糖类核酸2.按照特性分类大小链结构决定簇数目类型3.按照分子功能分类酶代谢物受体识别结构4.未来抗原的来源在各种媒介体内克隆的DNA的表达化学合成抗-独特型抗体抗原第二节寄生虫抗原的分离、纯化和鉴定寄生虫抗原的分离、纯化和鉴定是研究寄生虫免疫机理和免疫病理、研究寄生虫快速免疫诊断方法和疫苗的基础。一、寄生虫抗原的分离1.虫体抗原收集虫体，洗净表面粘附物，在磷酸缓冲液中之称匀浆，离心后的上清即为可溶性虫体抗原。球虫2.ES抗原排泄分泌抗原由培养寄生虫的培养液中经过浓缩、层析分级获得。可用于免疫诊断。3.膜抗原主要成分是膜蛋白，分为膜表面蛋白和膜组成蛋白。膜表面蛋白通过用金属螯合物或高离子强度的缓冲液溶解，然后通过分级处理获得。膜组成蛋白可以用清洁剂、有机溶剂溶解并分级处理获得。二、纯化通过物理的、化学的方法，利用寄生虫抗原的物理化学特性进行组分分离的过程称为寄生虫抗原的纯化。常用有以下3类方法1.凝胶层析凝胶层析是一种以分子大小为基础的分离技术，凝胶中每个颗粒的细微结构的小孔使被分离组分在流经途径上出现差别，大分子物质首先从孔外经过，首先被洗脱出来，其次是较小的组分，最后是小分子物质。常用的载体：交联葡聚糖如：Sephadex瑞典琼脂糖凝胶如：sepharoase瑞典bio-gel-A美国super-Ago-Gel美国聚丙烯酰胺凝胶如：bio-GelP美国2.离子交换层析离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。Ø

即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。。原理：依靠静电吸引溶液中带相反电荷的离子结合，利用待分离的各种蛋白质的等电点或所带电荷的不同而引起的与载体结合力不同和进行区分。分类：阴离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂纤维载体上结合阳离子基团如：DEAE纤维素DEAEsephadexQAE-sephadex阳离子交换剂离子交换剂上面带有阴离子如：CM-纤维素CM-sephadex注意点：要将样品中各组分分别洗脱，必须改变洗脱液的离子强度和PH，以提高解脱吸附的能力。带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。离子交换过程示意：起始吸附解吸完成x+:起始缓冲离子

y+：待分离离子

z+：待分离离子考虑因素：1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量根据分离过程的实验条件强酸强碱—应用广泛弱酸型—只能在碱性pH范围内使用弱碱型—只能在酸性pH范围内使用缓冲液的选择原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性洗脱剂

原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团改变pH或离子强度

增强洗脱液与离子交换剂的结合力

降低分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式：梯度洗脱每收集管中加入2ml茚三酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自来水冷却，观察氨基酸与茚三酮的显色反应，若生成紫色化合物，则说明收集到氨基酸。3、亲和层析亲和层析(affinitychromatography)

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。

原理

亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。载体的基本要求和选择

理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙烯酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/LNaOH或1Mol/LHCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。图示基本过程：

固相化

(Immobilise)

配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。

基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。吸附

(Adsorption)解吸(Elution)三.鉴定1.抗原组分及化学性质（1）SDS十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS由一个非极性的疏水区和一个强阴离子基团组成，在有SDS和还原剂存在的情况下低聚物的蛋白质解离成多肽链，各种大小的蛋白质在凝胶中形状相同，所以可以根据电泳的速度来判断分子量的大小。（2）双向电泳第一向电泳：等点聚焦电泳根据蛋白质的等电点进行分离第二向电泳SDS电泳，根据蛋白质分子量的大小进行分离电源等电聚焦仪（第一向）恒温水浴垂直板电泳仪（第二向）电源等电聚焦仪（第一向）恒温水浴垂直板电泳仪（第二向）（3）氨基酸序列测定最终目的是为了合成蛋白或者是多肽，诺氏疟原虫CSP，环子孢子蛋白质，12个氨基酸残基组成的重复结构。2.抗原活性极其特异性鉴定（1）血清学方法（2）体外实验淋巴细胞转化实验（3）动物实验过敏性反应T淋巴细胞与有丝分裂原在体外共同培养时，受到后者的刺激可发生形态学和生物化学的变化，部分小淋巴细胞转化为不成熟的母细胞，并进行有丝分裂，这种方法称为淋巴细胞转化试验(lymphocytetransformationtest)。T淋巴细胞在体外经植物血凝素激活后，可转化为淋巴母细胞，根据淋巴细胞的转化情况，可反应机体的细胞免疫水平。淋巴细胞转化率降低表示细胞免疫水平低下。空腹抽取静脉血3ml，加人25ul肝素抗