第一章基因工程概论2

三、基因工程（geneticengineering）基因工程研究发展史基因工程研究的主要内容或步骤

基因工程的应用3.1基因工程的概念

目前世界许多国家将生物技术，信息技术和新材料技术作为三大重中之重技术，而生物技术可以分为传统生物技术，工业生物发酵技术和现代生物技术。现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。

遗传学角度：一项遗传学技术将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，创造生物新品种或新物种的遗传学技术无性繁殖：称之为“克隆”行使正常功能：称之为“表达”生物化学角度：重组载体的操作在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的载体DNA：病毒、细菌质粒或噬菌体基因工程（geneticengineering）

也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。

基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物3.2基因工程研究发展史

基因工程的准备阶段基因工程的问世基因工程的迅速发展阶段基因工程的准备阶段

在40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。在50年代揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了信息的流向和表达问题。理论基础中心法则由于基因工程是一门内容广泛、综合性的生物技术学科，在60年代科学发展的水平下真正实施基因工程，还存在许多问题，特别是在技术方面。生物有机体，尤其是具有复杂结构的真核生物，其DNA含量是十分庞大的。DNAcontentofthehaploidgenomeisrelatedtothemorphologicalcomplexityoflowereukaryotes,butvariesextensivelyamongthehighereukaryotes.TherangeofDNAvalueswithinaphylumisindicatedbytheshadedarea.

每个基因都被认为是编码着一种蛋白质分子，所以人们一直十分重视研究单基因的结构与功能的关系。怎样分离单基因，以便能在体外研究其结构和功能的一系列问题，成为基因工程的关键所在。20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。

70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。这两项技术，使DNA的结构分析问题得到了根本的解决。1972年首次构建了一个重组DNA分子，并提出了体外重组的DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。技术基础理论上的三大发现：发现了生物的遗传物质是DNA发现了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机理发现了遗传信息的传递方式技术上的三大发明：限制性核酸内切酶和DNA连接酶基因工程的载体逆转录酶的发现基因工程的问世

1973年Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时与S.Boyer合作，将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已正式问世；并说明了质粒分子可以作为基因克隆的载体能携带外源基因导入宿主细胞，也说明了真核生物的基因可以转移到原核生物细胞中并在其中实现功能表达。1972年美国斯坦福大学的伯格第一次重组DNA获得成功.1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。基因工程的迅速发展阶段

自基因工程问世以的这二十几年是基因工程迅速发展的阶段。如果说20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，那么二十一世纪初将是基因工程应用研究的鼎盛时期。3.3基因工程的基本内容从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。基因工程过程示意图①②③④⑤⑥基因操作的基本步骤提取目的基因目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达一目的基因的检测和表达二提取目的基因将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来取出DNA用限制酶切断DNA

目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。提取目的基因的方法（一）直接分离基因——鸟枪法

将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。用限制酶切成许多片断提取目的基因的方法（二）人工基因合成法逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。DNA合成仪PCR扩增仪目的基因与运载体结合用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。提取质粒并用限制酶切割用连接酶将目的基因和质粒连接将目的基因导入受体细胞并扩增基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增目的基因的检测和表达（一）前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物目的基因的检测和表达（二）多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。3.4基因工程的应用

基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。

基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验1978

Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物

1982

第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985

第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼

1993

基因工程西红柿在美国上市1997

英国罗斯林研究所多莉羊1999.9

中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26

科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11

公布人类基因组基本信息生产基因工程药品基因工程与医药卫生基因诊断基因治疗如胰岛素、干扰素如用基因探针检测肝类病毒、诊断遗传病把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的在医学上的应用

基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质－肽类药物。胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液