抗癫痫药物的研究进展

抗癫痫药物的研究进展

癫痫是一种短期的反复性中枢神经系统功能障碍，主要表现为大脑中局部神经的异常兴奋和同步放电。癫痫是神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大病种,发病率大约为0.5%～1.0%。药物治疗是常规治疗方法,而临床上应用的抗癫痫药物主要作用于神经元,直接调控神经元的兴奋性。然而,约30%的癫痫患者发作仍旧得不到缓解,成为难治性癫痫,其中颞叶癫痫发展为难治性癫痫的几率更高达60%～70%。因此,深入研究癫痫的发病机制有助于发现新的抗癫痫药物作用靶点,从而为开发新的抗癫痫药物提供依据。星形胶质细胞是脑内数量最多的细胞,平铺并包裹于神经元和血管。长期以来星形胶质细胞被认为主要是对神经元起营养和支持作用,通过对离子和递质的转运,以维持神经元微环境的稳态。随着研究的逐渐深入,发现星形胶质细胞还可以调控神经元信号传递和动作电位的同步化发放,调控微脉管系统以及参与中枢神经系统的免疫应答等。在癫痫发病过程中,往往伴随着明显的星形胶质细胞数量、形态学以及生化指标改变,其中包括原有的星形胶质细胞和由干细胞新生成的星形胶质细胞。这些研究提示,星形胶质细胞在癫痫的发病机制中起重要作用。现从星形胶质细胞调控胞外谷氨酸稳态、星形胶质细胞谷氨酸受体、星形胶质细胞缝隙连接、星形胶质细胞调控水和钾离子代谢平衡,以及激活的星形胶质细胞释放免疫和炎性因子等5个方面探讨与癫痫发病的联系,期待对癫痫疾病进行深入研究。1星形胶质细胞氨基酸激活谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性递质。大量实验证明,癫痫与胞外谷氨酸浓度升高密切相关。谷氨酸通路功能失调,可能也是难治性癫痫的原因之一。尽管胞外谷氨酸主要来源于神经元,但是星形胶质细胞在维持胞外谷氨酸稳态中起到关键性的作用。首先,星形胶质细胞被证实可以释放谷氨酸。研究发现,神经元释放到突触间隙的谷氨酸激活相邻星形胶质细胞的代谢型谷氨酸受体(mGluRs),并且增加其胞浆内Ca2+浓度;而胞内Ca2+浓度的增加可诱导星形胶质细胞释放谷氨酸,反过来调节神经元突触活性。其次,大约80%～90%的胞外谷氨酸是由星形胶质细胞谷氨酸转运体摄取并清除的。被星形胶质细胞摄取的谷氨酸可以在谷氨酰胺合成酶(GS)催化下快速转化成没有兴奋毒性的谷氨酰胺,谷氨酰胺被转运回神经元,由线粒体谷氨酰胺酶重新合成谷氨酸,形成谷氨酸-谷氨酰胺循环。重新合成的谷氨酸可以直接释放或者转化成γ-氨基丁酸(GABA)。其中GS是谷氨酸代谢的关键酶,素有“谷氨酸开关”之称,主要表达在星形胶质细胞和少突胶质细胞中。大量证据表明,星形胶质细胞调控胞外谷氨酸稳态的任何一个环节,包括谷氨酸释放、摄取和谷氨酸-谷氨酰胺循环,均在癫痫疾病中扮演着重要的作用。1.1囊泡氨基酸转运体星形胶质细胞谷氨酸释放机制目前尚不明确。研究表明,星形胶质细胞合胞体内的Ca2+振荡可能是传递信号,导致星形胶质细胞递质释放的原因。但另有研究显示,星形胶质细胞Ca2+振荡并不是星形胶质细胞释放谷氨酸的充分条件。星形胶质细胞Ca2+升高一般发生在突起的比较小的范围内,导致递质释放的具体机制包括:谷氨酸的逆向摄取、缝隙连接通道、容积敏感性离子通道的开放及囊泡融合等。有研究还发现了星形胶质细胞内的囊泡活性区域。通过共聚焦显微镜和电镜观察发现,囊泡谷氨酸转运体VGLUT1位于星形胶质细胞突起内的类突触微囊泡上,其转录也被证实,但存在争议,并且只在培养的星形胶质细胞发现了突触融合,所以不能确定星形胶质细胞是否像神经元一样释放递质。G蛋白偶联的P2Y1受体也参与了这一过程,齿状回的星形胶质细胞通过Ca2+信号,调节谷氨酸以囊泡胞吐形式释放,激活P2Y1受体,进而增加突触前膜递质释放,增强突触传递。综上所述,海马星形胶质细胞Ca2+依赖的谷氨酸释放在一定条件下可以增强局部兴奋性突触的强度。越来越多的证据表明,星形胶质细胞Ca2+信号以及其释放的谷氨酸在癫痫疾病进展中扮演着重要的角色。无论是在体外培养的颞叶癫痫患者海马星形胶质细胞中还是在在体癫痫动物模型中,均探测到星形胶质细胞Ca2+信号的增强。Tian等人的研究首次提出,星形胶质细胞Ca2+的增高引起谷氨酸释放,进而引起邻近的神经元形成阵发性去极化偏移(PDSs),而PDSs是癫痫脑片和细胞的基础电生理现象,相当于发作间期放电。而该发现表明,导致PDSs的谷氨酸主要来自于星形胶质细胞而不是神经元。然而,近年来却有证据提示,星形胶质细胞释放的谷氨酸并不是形成痫样放电的必要条件。但是也有证据表明,星形胶质细胞释放的谷氨酸的确可以参与调控痫样放电的强度和阈值。目前,尚缺乏足够的证据来明确星形胶质细胞释放的谷氨酸在癫痫疾病中的确切作用,因此,后续的相关研究将尤为重要。1.2氨基酸转运体在癫痫中的作用现已经克隆的谷氨酸转运体有5个亚型:EAAT1(在啮齿类动物称作GLAST)、EAAT2(在啮齿类动物称作GLT-1)、EAAT3、EAAT4和EAAT5。其中,EAAT1/GLAST和EAAT2/GLT-1主要表达在胶质细胞中,EAAT3和EAAT4是神经元特有的转运体,而EAAT5则主要表达在视网膜上。EAAT2/GLT-1作为一种脑内表达量最多的谷氨酸转运体,对清除谷氨酸起到主要的作用。一旦EAAT2被敲除,谷氨酸水平就会抬高,敲除小鼠出现癫痫自发现象。利用转基因手段高表达EAAT2,在一定程度上可以阻止匹罗卡品模型中癫痫持续状态导致的小鼠死亡、神经病理性改变以及后期慢性自发性癫痫的进展;另一方面,用药物抑制GLT-1,痫样活动的阈值降低。利用药物增加GLT-1的表达水平,则减弱了戊四唑诱导的癫痫发作。同时,在结节性脑硬化模型中,药物诱导的GLT-1的增加也可以降低癫痫的发作频率。但是,在癫痫发生过程中谷氨酸转运体是否发生变化仍然存在争议。Mathern等发现,颞叶癫痫患者海马EAAT1-2的表达出现区域性改变。Proper等比较了颞叶癫痫患者硬化和非硬化海马组织谷氨酸转运体的表达,发现EAAT2在硬化的海马组织中表达明显下降。而Eid等人从颞叶癫痫患者切除的脑组织中并没有发现谷氨酸转运体表达改变。动物实验发现,杏仁核电点燃的SD大鼠GLT-1没有明显变化,只有GLAST略有下降。以上实验结果的差异可能与组间处理手段的差异以及癫痫的严重程度不同有关。迄今为止,仍然不清楚谷氨酸转运体是否参与了癫痫发病机制以及如何参与。有观点认为,谷氨酸转运体在癫痫中的作用,可能通过调节突触谷氨酸浓度直接控制突触后神经元兴奋性,更有可能改变了谷氨酸的下游代谢过程。因此,是否用β-内酰胺类抗生素激活谷氨酸转运体来治疗癫痫仍然需要进一步研究。1.3gs功能变化对癫痫的影响很多研究表明,GS与癫痫发病关系密切。2004年以来,陆续有文献报道了在不同化学点燃癫痫动物脑内GS表达减少和/或活性下降。Eid实验组在癫痫外科手术取出的硬化海马组织中观察到星形胶质细胞内GS表达明显下调;另一研究发现,在硬化海马中谷氨酸循环减慢。而且GS抑制剂氨基亚枫蛋氨酸(MSO)可以使胞外谷氨酸浓度明显升高,诱导正常动物出现严重癫痫发作。本课题组近期研究也发现杏仁核电点燃癫痫形成过程中,GS功能有一过性增强,并且在癫痫形成过程中起着促进作用(未发表结果)。这些实验提示癫痫发病与GS功能变化导致的谷氨酸-谷氨酰胺循环异常密切相关。GS功能下降促进癫痫发作有几个潜在机制。首先,GS功能下降可以导致谷氨酸在星形胶质细胞内堆积,使星形胶质细胞摄取谷氨酸障碍,从而导致胞外谷氨酸增加。其次,谷氨酰胺是合成GABA的重要原料,所以GS功能下降会导致谷氨酰胺水平的降低,从而减少抑制性突触末端的GABA水平,削弱了GABA能神经的抑制功能。2006年,Liang的实验结果支持了这个观点,用MSO抑制GS,可以减弱CA1区锥体细胞抑制性突触后电位(IPSCs)的幅度。进一步实验证实,这个作用是由于减少了囊泡内的GABA含量,而不是降低了突触前的递质释放能力。重要的是,这一作用可以通过恢复谷氨酰胺水平而逆转。然而,GS功能变化是癫痫发病的原因还是癫痫发病过程的一个代偿变化,逆转GS功能变化能否逆转癫痫进程等问题还需要进一步研究。2星形胶质细胞glur3抗体突变致癫痫患者脑损伤星形胶质细胞与神经元相似,都表达有离子型AMPA谷氨酸受体(GluR1-4)和mGluRs,这些受体可以在很多情况下被激活,如突触释放的神经递质、胶质释放的递质或脑内细胞外空间弥散的分子等。动物实验发现,GluR2缺陷的突变体小鼠,在自发和反复发作等癫痫活动中都早于或强于对照组,这说明AMPA受体GluR2亚单位缺陷降低了癫痫发作阈值。并且用GluR3抗体破坏星形胶质细胞,也可以明显影响癫痫进程。在人类正中颞叶癫痫患者脑组织中发现,星形胶质细胞GluR1表达增加,以及受体反应时间延长。受体开放时间的延长会促进Ca2+和Na+内流,阻断星形胶质细胞K+通道,减弱星形胶质细胞对K+的缓冲功能,进一步增强去极化。对癫痫患者硬化的海马进行免疫检测,发现激活的星形胶质细胞mGluR2/3、mGluR4和mGluR8的表达都出现变化。同样,在颞叶癫痫的动物模型中,海马mGluR3、mGluR5和mGluR8出现上调;基因突变的癫痫动物模型(mnd小鼠)、海马GluR1-3受体亚单位表达也明显升高,这些受体的激活导致星形胶质细胞内Ca2+浓度升高,诱导星形胶质细胞释放谷氨酸。但是,星形胶质细胞谷氨酸受体变化是癫痫的起因还是结果依然不清楚。3星形胶质细胞网络缝隙连接是位于相邻细胞膜上的跨膜通道,由2个六聚体连接子(半通道)组成,而连接子则由6个缝隙连接蛋白构成。人类连接蛋白家族包括21个成员,其中连接蛋白(connexin,Cx)26、29、30、32、36、37、40、43、45、46和47分别在脑内不同部位、不同细胞类型以及发育不同阶段合成并行使功能。连接蛋白既能在邻近同一类细胞之间形成连接,也能在神经元-星形胶质细胞或星形胶质细胞-少突胶质细胞这样不同种类细胞间形成连接。缝隙连接允许电脉冲扩布和小分子(1.0～1.2kD)交换,如离子、第二信使,也包括肌醇1,4,5-三磷酸、谷氨酸、谷胱甘肽、ADP、ATP等代谢产物。近年来,越来越多的研究者开始关注由缝隙连接蛋白(主要是Cx43和Cx30)形成的星形胶质细胞网络及其生理功能。一方面,神经元活动可以调控星形胶质细胞网络,影响缝隙连接通道的通透率;另一方面,星形胶质细胞网络可以调控神经元活动。同时,星形胶质细胞缝隙连接以及网络可能在一些中枢神经系统疾病比如癫痫中起着重要的作用。在癫痫患者的颞叶新皮质、海马和皮层中,星形胶质细胞连接蛋白Cx43及其mRNA均有一定的表达上调。海马脑片离体实验也发现,无论在是Co2+还是荷包牡丹碱诱导癫痫后,Cx43及其mRNA也有一定的上调。然而,Cx43在各类在体癫痫动物模型中的表达变化备受争议,有上调、不变甚至是下调。这些差异可能与癫痫模型、被测脑区、检测时间点以及癫痫发作的严重程度有关。条件性基因敲除手段和选择性抑制剂的出现使得区分研究星形胶质细胞缝隙连接在癫痫中的作用成为可能。Wallraff等人发现,条件性敲除胶质细胞的Cx43和Cx30可以引起自发的癫痫样放电,同时降低无镁诱发的痫样放电的阈值,这种作用主要因为抑制了星形胶质细胞缝隙连接通道对K+的缓冲作用而导致的神经元兴奋性的增强。然而,Rouach等人则发现,癫痫样放电会导致谷氨酸释放增加,增强葡萄糖在星形胶质细胞缝隙连接通道中的运输,从而维持了癫痫样放电。利用Cx43模拟肽长时间抑制星形胶质细胞缝隙连接可以减弱海马脑片的自发癫痫样放电。星形胶质细胞缝隙连接抑制剂甲氯灭酸能抑制破伤风毒素引起的顽固性局灶性皮质癫痫。本实验室的研究发现,甲氯灭酸能显著抑制杏仁核电点燃和海马快速电点燃的癫痫形成进展(尚未发表)。以上研究提示,星形胶质细胞缝隙连接在癫痫中似乎具有双重作用,如果抑制缝隙连接通道,一方面因为影响了K+的扩散而导致神经元兴奋性的增强,增加癫痫易感性;同时又能阻止葡萄糖等能量物质的运输,阻止神经元持续兴奋,从而抑制癫痫。鉴于这种矛盾,星形胶质细胞缝隙连接通道在癫痫中的作用仍需要进一步研究。4星形胶质细胞的k+和k-aqp4表达增加了海马脑片的兴震性星形胶质细胞可通过调节细胞内外水和K+的转运,影响神经元的兴奋性。在哺乳动物脑内,星形胶质细胞主要表达水通道蛋白4(AQP4),集中在血管周围的终足。这种分布特点使AQP4更适合于调节血液与脑内胞外空间之间的双向水分流动,从而调节脑内神经元间隙的渗透压。动物实验显示,阻断AQP4则星形胶质细胞活化,AQP4基因缺陷小鼠会出现水中毒、局部脑缺血;在血管源性水肿模型出现水分清除障碍,随之脑内水分减少。这些结果提示,AQP4对水分转运发挥着重要作用。在癫痫患者硬化的海马中,AQP4从血管周围重新分布到突触周围,伴随着表达的显著增加。这种分布可促进突触附近的水分摄入,减慢远距离的水分排出,导致癫痫发作时星形胶质细胞肿胀,限制了神经网络的胞外空间。降低胞外容积对胞外离子和递质浓度变化有放大作用。如果胞外容积减小,胞外空间电阻增加,神经元间假突触联系增加。再者,在星形胶质细胞肿胀时,通过容积敏感性阴离子通道释放的递质也会增多;反之,增加胞外容积,使暴露在高K+或无Ca2+培养液中的海马脑片兴奋性降低。利尿药呋塞米和布美他尼就是通过阻断胶质细胞Na-K-2Cl共同转运体,减少细胞体积而产生抗癫痫作用。可见,胞外容积改变导致的电解质失衡,与神经元兴奋性密切相关。以上研究提示,激活的星形胶质细胞通过体积变化,改变胞外容积,可以控制胞外递质和离子的浓度和扩散速度,改变胞外空间渗透压,提高脑组织兴奋性。以往研究表明,任何损害胶质细胞摄取K+的因素都可以促进惊厥。难治性颞叶癫痫和海马硬化患者的海马脑片实验都证实,高K+可以诱发癫痫样活动。胞外K+浓度毫摩尔甚至微摩尔级别的增加就可以强烈增强癫痫样活动。并且,当神经元过度兴奋时,胞外K+浓度可以从小于3mmol/L升高到10～12mmol/L。星形胶质细胞对脑内K+的平衡起着重要作用。可以将K+从高浓度区域清除,从而恢复胞外正常K+水平。其中,星形胶质细胞的内向整流K+通道(Kir)促进K+的摄取和缓冲,在胞外K+缓冲中起着重要作用。在脑内,大约50%的星形胶质细胞都表达Kir4.1,负责将K+从胞外转运入星形胶质细胞合胞体。和AQP4相似,Kir4.1在星形胶质细胞内的分布并不均匀,主要分布在血管周围的星形胶质细胞终足。在正常情况下,大量K+由兴奋的神经元释放到胞外,被星形胶质细胞和神经元摄取。值得注意的是,K+的摄取伴随着水分通过AQP4进入星形胶质细胞,然后多余水分堆积在血管周围的终足。这样,将兴奋时局部胶质细胞肿胀,胞外空间缩小的影响最小化。在正中颞叶癫痫患者的硬化海马中发现Kir4.1通道丢失,在耐药性癫痫患者和慢性癫痫动物模型的脑组织中也相继发现星形胶质细胞Kir通道表达、定位和功能的改变。在癫痫发作活动中,胞外K+浓度明显升高;在颞叶癫痫患者硬化海马内,星形胶质细胞的K+清除也明显减缓。这提示癫痫持续状态后,星形胶质细胞K+流减弱。在非硬化海马,超极化电位引出的内向整流电流,被星形胶质细胞130mV的膜电位灭活。而在硬化海马,星形胶质细胞的膜电位要小很多。同样,与非硬化海马比较,硬化海马星形胶质细胞K+的内向和外向传导效率明显降低。以上研究提示,硬化海马内的K+通道可能存在缺陷,导致K+的缓冲障碍,这可能是癫痫组织过度兴奋的基础,但是K+通道缺陷形成的细胞和分子机制还不清楚。从分布上看,AQP4和Kir4.1定位相似,免疫共沉淀和共定位于同一亚细胞区域,而且两者都参与K+调节,所以AQP4和Kir4.1可能一起调节胞外空间的水和K+水平。在AQP4基因缺陷小鼠,K+清除变慢,但对电刺激时皮层细胞外K+的峰浓度无影响。相应的这些动物刺激诱导发作的时程也明显延长。这表明,胶质终端的水分流动对K+缓冲是必须的。血管周围星形胶质细胞终足AQP4和Kir4.1的密度和K+从血管转运入脑组织的速度是胞外空间的主要决定因素。因此,Kir4.1的功能可能与AQP4协同调节胞外容积密切相关。癫痫状态下,激活星形胶质细胞的AQP4和Kir4.1重新分布障碍,导致K+清除受阻,水分平衡失调,引起胞外空间容积改变并伴随K+浓度和小区域渗透压改变,从而提高神经元兴奋性。5星形胶质细胞激活的作用星形胶质细胞合成并释放多种免疫和抗炎分子,参与中枢神经系统的炎症应答。其中包括炎症趋化因子类、细胞因子类、肿瘤坏死因子、转录因子、转录相关因子、补体等。在硬化海马中发现星形胶质细胞分泌的免疫和炎症反应蛋白表达上调。在颞叶癫痫患者明显硬化的海马CA