cd40配体对cd40阴性肺癌细胞系转染cd40后的调节作用

cd40配体对cd40阴性肺癌细胞系转染cd40后的调节作用

sd40是一种含量量为45000的白色膜蛋白。它主要出现在抗原性细胞、细胞和肿瘤细胞上。CD154是CD40的配体,又称CD40L,它是分子量为39000的Ⅱ型跨膜糖蛋白,又称肿瘤坏死因子相关活化蛋白(TRAP)。CD40/CD154是免疫细胞间重要的信号传导通路,参与多种体液免疫和细胞免疫,在炎症、自身免疫性疾病和心血管病的发生发展中起重要作用关于CD40与肿瘤的发生发展及转移等方面的研究越来越多,CD40/CD154抗肿瘤免疫治疗成为肿瘤的免疫治疗和基因治疗的潜在发展方向。Turner等报道,对于CD40高表达肿瘤,CD154与CD40连接后能抑制肿瘤细胞的生长和促进细胞凋亡。那么,CD154对于CD40弱表达和不表达的肿瘤能否发挥其抗肿瘤作用,对转染CD40cDNA后CD40高表达的肿瘤能否起作用,目前国内尚无报道,而国外也少见报道,且结论不一。我们以CD40表达阴性的人GLC-82肺癌细胞系为例,通过转染CD40cDNA后,建立CD40高表达的细胞系(GLC-82/CD40),以此来研究CD154对GLC-82/CD40肺癌细胞的调节功能,评价CD40作为治疗靶抗原的潜能。材料和方法1.材料GLC-82(肺腺癌)、Calu-3(肺腺癌)和3D5(B细胞)细胞系由中国医学科学院基础医学研究所提供。2.克隆抗体和试剂盒菌株E.coliDH5α和真核表达载体pCDNA3由中国医学科学院基础医学研究所提供。所用单克隆抗体和试剂盒均为进口产品。EPICSELITEESP型流式细胞仪购于美国BeckmanCoulter公司,PCR仪购于北京君益机电技术公司。3.细胞培养选取对数生长期细胞,根据四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)试验结果,加入0.1μg/ml的CD40L(终浓度),培养1,3,5d及5d后停用CD40L换常规培养液,继续培养48h,收集细胞。4.tcctcgag3CD405′端引物序列为:5′CCCAAGCTTATGGTTCGTCTGCCTCTGCAG3′,内含HindⅢ酶切位点;CD403′端引物序列为:5′AT-AAGAATGCGGCCGCTCACTGTCTCTCCTGCACTGAG3′,内含NotI酶切位点。5.遗传因素检测cd40提取并定量蛋白,采用半干转印硝酸纤维素膜转移。6.d5细胞和癌表型的检测细胞表面抗原检测的免疫荧光标记法用于3D5细胞和癌细胞表型的检测;AnnexinV/PI试验用于细胞凋亡的检测;PI染色法用于细胞周期的检测。7.mtt测试CD40L的终浓度梯度为0,0.01,0.1,0.5和1.0μg/ml,培养1～5d。结果一、阴性细胞系统转染cd40cdna1.准备cd40cDNA模板:3D5细胞CD40表达量高达99.9%,因此,以3D5细胞作为制备CD40cDNA的模板。2.-cd40的使用图电泳结果显示,CD40cDNA和pCDNA3-CD40的长度均与所设计的一致,分别为834bp和1922bp(图1)。所连接的cDNA经测序,表明符合CD40cDNA碱基序列。3.空载体pccda3使用分光光度计法对质粒浓度进行测定,空载体pCDNA3为4764.6816μg/ml;连接载体pCDNA3-CD40为3574.7905μg/ml。4.glc-77细胞在相对分子量和转染前的染色结果转连接载体pCDNA3-CD40cDNA的细胞在相对分子量48000处出现一条染色的蛋白带,而转染空载体和转染前GLC-82细胞无明显的条带出现(图2)。5.cd40克隆细胞的表达率转染前GLC-82细胞CD40的表达率为0.2%,转染空载体细胞的表达率为2.6%,转染CD40克隆细胞的表达率最高,为95.9%。选定该克隆进行大量扩增和培养,并将此细胞系命名为GLC-82/CD40。二、cd40l对fas和gfr的影响1.CD40L对MHC-Ⅰ、ICAM-1、Fas和EGFR表达的影响:CD40L与CD40作用后,使GLC-82/CD40和阳性对照CALU-3(原有CD40高表达的肺癌细胞)细胞上MHC-I、ICAM-1和Fas分子的表达增强,EGFR的表达减弱。CD40L作用5d后,ICAM-1平均荧光强度(mean值)分别上调了4.8倍和8倍,MHC-1的mean值分别上调了4.2倍和5倍;Fas分别上调了2.7倍和5倍;而EGFR下调了2.5倍和3倍。停用CD40L继续培养48h后,这些分子的mean值均有明显回复(图3,4)。2.CD40L对肺癌细胞生长的影响:MTT试验显示,CD40L作用后,GLC-82/CD40和阳性对照细胞的生长均受到抑制,第5天受抑最明显,受抑率分别为30%和50%。停用CD40L48h后,受抑有所下降,受抑率分别为10%和15%(图5)。3.CD40L对细胞周期和凋亡的影响:CD40L对GLC-82/CD40细胞周期时相影响不明显,周期各时相的百分率无明显变化。而阳性对照细胞的异倍体百分率降低,细胞合成期(S)向增殖分裂期(G2/M)的进入受到了阻制,停用CD40L48h后,阻滞有所减轻。而全部细胞系均未出现凋亡现象,凋亡细胞率(AnnexinV+/PI-或AnnexinV+/PI+)均<1%。4.CD40L对CD40阴性的GLC-82肺癌细胞系的细胞表型MHC-I、ICAM-1、Fas、EGFR、细胞生长、周期时相及凋亡等方面均无明显的影响。cd40l作为探针的可能和作用免疫导向治疗和基因治疗已成为肿瘤治疗的新热点,采用CD154(CD40L)基因导入靶向肿瘤细胞,或使用CD154可溶形式或者具有协同作用的抗CD40单抗(CD40mAb)用于治疗恶性肿瘤已取得了一些可喜的结果。Imaizumi等报道,将CD40LcDNA转导的鼠肺癌细胞系注入同基因C57BL/6鼠,同对照组相比,CD40LcDNA转导的鼠肺癌细胞系成功地排斥了肿瘤细胞的生长;而在CD40阴性的小鼠,试验组和对照组没有差别,提示对肿瘤细胞的排斥源于CD40/CD154相互作用。vanMierlo等进一步的研究证实,将协同作用的抗CD40抗体注入表达CD40的小鼠体内能通过CD8+T细胞清除小鼠体内的肿瘤,而在CD40缺乏的小鼠上治疗无效,这表明,CD40L对肿瘤的治疗需要宿主细胞表达CD40。以上研究提示,CD40L作为免疫导向治疗的探针有可能为肺癌治疗提供新的途径。我们的实验结果表明,CD40L增强了3种CD40高表达肺癌细胞系(如Calu-3)的Fas、ICAM-1和MHC-I类分子的表达和下调了EGFR的表达,并抑制了细胞生长,阻断了细胞由S期进入G2/M期。但CD40L对CD40中低表达和不表达的肺癌细胞无明显影响。我们知道,CD40L是通过与CD40连接后对肺癌细胞产生作用,为此,我们将外源基因CD40cDNA转染到CD40不表达的细胞(GLC-82)中,建立CD40高表达的肺癌细胞(GLC-82/CD40),并观察CD40L对该细胞的作用。结果表明,CD40L同样增强了MHC-I、ICAM-1和Fas的表达,并下调了EGFR的表达,由此增强了T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力,抑制了肿瘤细胞的生长。尽管CD40L上调了CD40高