寄生虫实验技术-课件

病原学检查粪便检查血液检查法排泄物与分泌物等的检查其它组织器官检查第一页第二页，共36页。粪便检查直接涂片法厚涂片透明法浓聚法沉淀法毛蚴孵化法浮聚法肛门拭子检查法试管滤纸检查法虫卵计数法定量透明法淘虫检查法带绦虫孕节检查法第二页第三页，共36页。直接涂片法检查蠕虫卵、原虫包囊和滋养体。简便，连作3次以提高检出率。滴一滴生理盐水于载玻片，用牙签挑取绿豆大小的粪块，在生理盐水中涂抹均匀；厚度以可辨认下面的字迹为宜。也可固定后染色。一般在低倍镜下检查，用高倍镜观察时加盖片。检查包囊时用碘液。检查隐孢子虫卵囊时用金胺酚改良抗酸染色法。第三页第四页，共36页。厚涂片透明法取约5mg粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油－孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开。置于30～36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干，即可镜检。第四页第五页，共36页。沉淀法原虫包囊和蠕虫卵等比重大时效果较好。重力（离心）沉淀法：取粪便20～30g，加水混悬后用2～3层湿纱布过滤；滤液静置25分钟或离心（1500～2000rpm）1～2分钟，重复洗涤直至上清液清澈为止。最后取沉渣涂片镜检。检查包囊时，换水间隔时间宜延长至约6h。第五页第六页，共36页。浮聚法利用比重较大的液体，使原虫包囊或蠕虫卵上浮，集中于液体表面。检查钩虫卵效果最好。饱和盐水浮聚法：取黄豆粒大的粪便置于浮聚瓶中，加入少量饱和盐水调匀，再慢慢加入饱和盐水到液面略高于瓶口但不溢出为止。在瓶口覆盖一载玻片，静置15分钟后，将载玻片迅速提起翻转，镜检。可用硫酸锌或蔗糖代替饱和盐水。第六页第七页，共36页。毛蚴孵化法在适宜温度的清水中，血吸虫卵内的毛蚴短时间内可孵出。取粪便约30g，先经沉淀法浓集，将粪便沉渣倒入三角烧瓶内，加清水至瓶口，在20～30℃的条件下经4～6小时后肉眼或放大镜观察结果。如水面下有白色点状物作直线来往游动，即是毛蚴。必要时也可用吸管将毛蚴吸出镜检。第七页第八页，共36页。毛蚴促孵法将沉淀法处理后的粪便沉渣置于三角瓶内，不加水，或将粪渣置于吸水纸上，再放在20～30℃温箱中过液。检查时，加清水，2小时后就可见到孵出的毛蚴。第八页第九页，共36页。肛门拭子检查法适于肛周产卵（蛲虫），或肛门附近可发现虫卵（带绦虫）的寄生虫虫卵检查法。棉签拭子法：将湿棉签或角匙在肛门周围擦拭，随后将其放入盛有饱和盐水的试管中充分溶解，然后取液面液体进行镜检，也可离心后取沉渣镜检。透明胶带法：用长约6cm，宽约2cm的透明胶带粘擦肛门周围皮肤，取下胶带，平贴在玻片上镜检。第九页第十页，共36页。试管滤纸培养法也称钩蚴培养法。根据钩虫卵在适宜条件下可在短时间内孵出幼虫的原理设计的方法。加水约1ml于洁净试管内，将滤纸剪成与试管等宽但管稍长的T字型纸条。取粪便约0.2～0.4g，均匀地涂抹在纸条竖条的上部2／3处，再将纸条插入试管，下端浸泡在水中，粪便不接触水面。在20～30℃条件下培养3天后肉眼或放大镜检查试管底部。钩蚴在水中作蛇形游动，虫体透明。第十页第十一页，共36页。虫卵计数法斯陶尔（Stoll）氏法。在三角烧瓶的颈部画56和60ml两个刻度。先加0.1mol/LNaOH溶液至56ml处，再加粪便到60ml处，然后放进玻璃珠充分摇动混悬。取0.075或0.15ml粪液置于载玻片，镜下计算虫卵数。乘以200或100得每克粪便虫卵数。

雌虫数＝每克粪便虫卵数×24小时粪便克数/

已知雌虫每天排卵总数成虫总数＝雌虫总数×2第十一页第十二页，共36页。定量透明法蠕虫卵的检查及计数。将约4×4cm的100目尼龙网或金属筛网覆盖粪便，自筛网上刮取粪便，填满置于载玻片上的定量板的模孔。掀起定量板，将留下的粪样覆盖一含甘油－孔雀绿溶液的约为5.0～2.6cm的玻璃纸条，展平加压后粪便铺成长椭圆形。经1～2h粪便透明后镜下计数。将所得虫卵数×24，再乘粪便性状系数，即为每克粪便虫卵数。第十二页第十三页，共36页。淘虫检查法考核驱虫疗效，粪便中淘取蠕虫鉴定计数。取服药后24～72小时的全部粪便，加水搅拌，用筛（40目）或纱布滤出粪渣，经水反复冲洗后，倒在盛有清水的大型玻皿内。检查混杂在粪渣中的虫体时，应在玻皿下衬以黑纸。第十三页第十四页，共36页。带绦虫孕节检查法绦虫节片用清水洗净，置于两载玻片之间，轻轻压平，对光观察内部结构，并根据子宫分支情况鉴定虫种。也可用注射器从孕节后端正中部插入子宫内徐徐注射炭素墨汁或卡红，待子宫分支显现后计数。第十四页第十五页，共36页。血液检查诊断疟疾、丝虫病。皮肤消毒后用取血针刺破皮肤，挤出血滴，用载玻片蘸取。然后用一边缘光滑的载片为推片，将血滴推成血膜。充分晾干后，用甲醇或无水酒精对血膜进行固定。然后进行染色，晾干后镜检。第十五页第十六页，共36页。排泄物与分泌物的检查1．痰液可查肺吸虫卵、棘球蚴的原头蚴、粪类圆线虫幼虫、蛔蚴、钩蚴等。先用直接涂片法检查，阴性时改用浓集法。浓集法：收集多量痰液置玻璃杯中，加入等量10％NaOH溶液，搅匀后置37℃温箱内消化，待痰液变为稀液时分装离心管内，以1500rpm离心5～10分钟，取沉渣涂片检查。第十六页第十七页，共36页。排泄物与分泌物等的检查2．十二指肠液和胆汁：检查贾第鞭毛虫滋养体、华支睾吸虫卵、肝片形吸血卵和布氏姜片虫卵等；可滴于载玻片上加盖片后直接镜检。为提高寄生虫检出率，可加生理盐水稀释搅拌后，分装离心管，以2000rpm离心5～10分钟，取沉渣涂片镜检。如过于粘稠，先加10％NaOH消化后再离心。第十七页第十八页，共36页。排泄物与分泌物等的检查3．尿肾虫病等。一般离心后取沉渣镜检。乳糜尿时需加等量乙醚，用力振荡使脂肪溶于乙醚。然后除去脂肪层后离心，取沉渣镜检。4．阴道分泌物：伊氏锥虫、阴道毛滴虫等。直接涂片法。第十八页第十九页，共36页。其它器官组织检查1．骨髓：利什曼原虫无鞭毛体等。直接涂片；甲醇固定，染色，油镜检查。2．淋巴结：利什曼原虫、丝虫成虫：切面涂片，染色后镜检。3．直肠粘膜：日本血吸虫卵及阿米巴滋养体等。从直肠粘膜病变组织取样，压片镜检或染色镜检。第十九页第二十页，共36页。其它器官组织检查4．肌肉压片检查：旋毛虫幼虫、猪囊尾蚴等。从腓肠肌或肱或股二头肌取米粒大小的肌肉或肌肉结节，置于载玻片上，加50％甘油一滴，盖上另一载玻片均匀用力压紧，低倍镜下观察。须立即检查，否则幼虫变得模糊，不易检出。也可经组织固定后作切片染色检查。第二十页第二十一页，共36页。其它器官组织检查5.皮屑检查：疥螨。用刀片刮取健康部和病患交界处的痂皮进行镜检（需出血）。直接检查法：置平皿或黑纸上，曝晒或加热（40-50℃），30-40分钟后，移去皮屑检查白色虫体。显微镜镜检：置载玻片，滴加煤油、10％NaOH、液体石蜡，50％甘油后，上加另一载玻片按压后检查。虫体浓集法：置试管中，加入10％NaOH后过夜或加热使皮屑溶解，而后静置或离心（2000rpm，5min）使虫体沉淀后镜检。第二十一页第二十二页，共36页。免疫学方法皮内试验染色试验环卵沉淀试验间接血凝试验免疫荧光酶联免疫吸附试验斑点ELISA免疫酶染色试验单克隆抗体第二十二页第二十三页，共36页。皮内试验利用宿主的速发型变态反应，将特异抗原液注入皮内，观测皮肤丘疹及红晕反应以判断有无特异抗体（IgE）的存在称皮内试验。操作简单，并且可即时观察结果，适宜现场应用。皮内试验用于多种寄生虫病的检测，如血吸虫病、肺吸虫病等。最常用于血吸虫病的调查。第二十三页第二十四页，共36页。染色试验染色试验（dye

test，DT）：独特的免疫反应，是目前诊断弓形虫病较好的方法，广泛用于该病的临床诊断和流行病学调查。新鲜弓形虫滋养体和正常血清混合，在37℃1小时或室温数小时后，大部分弓形虫变为圆形或椭圆形，用碱性美蓝染色时着色很深。但新鲜弓形虫和免疫血清混合时，虫体仍保持原有形态，用碱性美蓝染色时，着色很浅或不着色。第二十四页第二十五页，共36页。环卵沉淀试验以血吸虫整卵为抗原的特异血清学试验。卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与检测血清内的特异抗体结合，可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀，在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率（环沉率）。第二十五页第二十六页，共36页。间接血凝试验间接血凝试验是以红细胞作免疫配体的载体，并以红细胞凝集进行读数的血清学方法。最常用的红细胞为绵羊或人（O型）红细胞，IHA操作简便，敏感性高，适于现场使用，可作为辅助论断，流行病学调查及综合诊断方法。在多种寄生虫感染中应用，如血吸虫，疟疾、猪囊虫，旋毛虫，肺吸虫，阿米巴，弓形虫，肝吸虫等。第二十六页第二十七页，共36页。免疫荧光法免疫荧光法是对抗原抗体反应进行特异荧光染色的诊断技术。诊断疟疾、丝虫病及血吸虫病、肺吸虫病、华支睾吸虫病、包虫病及弓形虫病等。1．直接法：每查一种抗原必须制备与其相应的荧光标记的抗体。目前很少应用。2．间接法：也称间接荧光抗体法。将抗原与未标记的特异性抗体（如患者血清）结合，然后使之与荧光标记的二抗（抗抗体）结合，三者的复合物可发出荧光。第二十七页第二十八页，共36页。酶联免疫吸附试验广泛用于多种寄生虫感染的宿主体液（血清，脑脊液等）以及排泄分泌物（尿，乳，粪便等）内特异抗体或抗原微粒的检测。酶联试验的基本操作过程可分为：①固相包被；②温育洗涤；③加样；④酶结合物反应；⑤底物显色；⑥终止反应读取结果等若干步骤。第二十八页第二十九页，共36页。斑点ELISA斑点ELISA（dot-ELISA）是近年新发展的一种ELISA技术，在固相载体上吸附抗原和抗体，然后和被测物反应，底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色，目测或用光密度扫描仪定量。dot-ELISA可用来检测抗体，也可用来检测抗原，由于该法检测抗原时操作较简便，故目前多用于抗原检测。第二十九页第三十页，共36页。免疫酶染色试验免疫酶染色试验是以组织切片，印片或培养物涂片用作待检材料进行过氧化物酶特异免疫染色，在光镜下检示样本的特异性抗原。在蠕虫和原虫感染中均有应用。血吸虫病、丝虫病、囊虫病、华支囊吸虫病、肺吸虫病、包虫病和弓形虫病等。第三十页第三十一页，共36页。单克隆抗体单克隆抗体（McAb）广泛用于寄生虫病临床与实验研究。分型和鉴定；免疫诊断方法以及寄生虫感染免疫，保护性免疫和虫苗制备等方面。用于疟疾、弓形虫病、血吸虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、丝虫病等方面。第三十一页第三十二页，共36页。检测新技术－分子生物学方法免疫印渍试验DNA探针技术PCR技术第三十二页第三十三页，共36页。免疫印渍试验免疫印渍试验是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术