克氏综合征患者新一代高通量测序植入前遗传学诊断的临床应用价值

克氏综合征患者新一代高通量测序植入前遗传学诊断的临床应用价值

47.0.2%，克里斯综合征的发病率约为0.1%0.2%，主要表现为无精神症、骨肿瘤、睾丸功能低下，少数患者表现为严重的精神障碍。1材料和方法1.1反复选择筛查选取2016~2017年在本院生殖中心进行PGD助孕的5例克氏综合征患者及其配偶作为克氏组,取同期因反复流产行植入前遗传学筛查(preimplantationgeneticdiagnosisscreening,PGS)的20例患者资料进行对照,设为反复流产组。1.2实验方法1.2.1gnrh-a/fsh/hgm长方案根据患者的年龄和卵巢储备功能,采用本中心常规的GnRH-a/FSH/HMG长方案或GnRH-ant/FSH/HMG拮抗剂方案进行卵泡促排,当2个以上主导卵泡直径大于18mm时给予HCG1×101.2.2ection培养系统所有患者均行卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)。采用G系列序贯培养系统(Vitrolife)进行胚胎培养。受精后5~6d,胚胎培养至囊胚阶段,囊胚质量优于3BC的胚胎行囊胚活检。利用激光法于囊胚内细胞团对侧的滋养外胚层分离出3~8个细胞进行检测。冷冻活检后的囊胚,等待高通量测序结果。1.2.3基因扩增和库构建法采用胚胎植入前遗传学筛查文库制备试剂盒(Pre-implantationGeneticsScreeningLibraryPrepKit,YikonGenomics,China),运用MALBAC-Lab(multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles)技术,即基于多次退火环状循环扩增技术的基因扩增和文库构建法对活检样本进行全基因组扩增和文库构建,建库以后利用MiniSeq测序仪进行上机测序,并对测序的数据进行分析与解读。高通量测序部分由亿康基因公司负责技术支持。1.2.4单囊胚移植外引PGD/PGS结果正常的囊胚择期进行复苏与移植。患者采用人工周期进行内膜准备,囊胚复苏按照加藤公司的玻璃化解冻试剂盒(KitazatoBioPharmaCo.Ltd,Japan)说明书进行,所有患者均为单囊胚移植。1.3术后护理移植后14d测血-HCG,阳性者2周后B超检查发现宫内孕囊及胎心确定为临床妊娠。孕16~20周行羊水穿刺检查胎儿染色体。1.4统计分析采用SPSS16.0统计软件系统进行数据分析。计量资料的组间均数比较采用t检验,组间率的比较采用χ2结果2.1临床数据5例克氏综合征中,4例核型为47,XXY,1例为嵌合体,核型为47,XXY2.2反复推流式引产阶段20例克氏组患者共进行了5个ICSI周期,获卵99枚,其中成熟MⅡ卵91枚;行ICSI后受精57枚,受精率为62.6%(57/91),卵裂率为100.0%;第3天(D3)继续培养44个胚胎,形成17个可利用囊胚(可用于活检的囊胚),可利用囊胚形成率为38.6%(17/44)。20例反复流产患者共进行了20个ICSI周期,共获卵312枚,其中成熟MⅡ269个,行ICSI后受精207个,受精率为77.0%(207/269),第3天(D3)继续培养203个胚胎,形成82个可利用囊胚,可利用囊胚形成率为40.4%。两组患者的女方年龄、平均获卵数、MⅡ率、卵裂率和可利用囊胚形成率间的差异均无统计学意义,但克氏组的受精率明显低于反复流产组(P<0.05)(表1)。2.3反复流组的染色体异常情况克氏组患者行ICSI术后,1例嵌合体患者未获得可利用囊胚,取消周期;其余4例患者共获得17个囊胚,高通量测序结果显示,12个囊胚未检出异常(46,XN),其余5个囊胚为非整倍体,染色体非整倍体率为29.4%。检测的17个囊胚中,未发现性染色体异常,5个异常的囊胚均为常染色体的非整倍体(表2)。反复流产组共检测囊胚82个,其中50个未检出异常(46,XN),32个为非整倍体,染色体非整倍体率为39.0%。克氏组的染色体非整倍体率低于反复流产组,但差异无统计学意义(29.4%vs.39.0%,P>0.05)。进行PGD检测的4例克氏组患者均有可移植囊胚,并且都已行复苏后单囊胚移植。其中,1例患者夫妇获得3个正常囊胚,其配偶移植1个囊胚后顺利妊娠,已分娩一健康女活婴,染色体核型检测为46,XX;1例患者送检的2个囊胚中,1个正常,1个为15号单体(图1),其配偶移植正常囊胚后妊娠,目前孕6月,羊水穿刺显示胎儿核型为46,XN;1例目前配偶孕2月;另1例移植后未获得妊娠。3克氏综合征患者配子和胚胎中性染色体异常发生率的发生率47,XXY(克氏综合征)在男性不孕人群中的发生率约为3.1%,主要表现为无精症、睾丸功能低下