植物叶绿素提取和测定的改进方法

植物叶绿素提取和测定的改进方法

常绿叶子（chl）是反映植物生理的重要指标。测定叶色含量是植物生物科学以及科学研究和教育的重要内容之一。根据叶绿素不溶于水而易溶于有机溶剂的性质,已筛选出多种提取叶绿素的溶剂,常见的有甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、氯仿、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)及二甲基甲酰胺等,这些溶剂各有优缺点(苏正淑和张宪政,1989;Wellburn,1994;Porra,2002)。考虑到叶绿素在这些溶剂中的溶解度、提取速度、稳定性以及溶剂的毒性、挥发性和经济成本等因素,Arnon(1949)提出的80%丙酮提取法应用最为普遍。因为在常用提取溶剂中,叶绿素在80%丙酮中的溶解度最大,80%丙酮作为溶剂可减少丙酮的挥发,加快植物组织尤其是干组织中叶绿素的提取速度(干材料内水分少,一些水溶性的物质在无水丙酮里难以溶解,阻碍叶绿素的溶出),也可以避免组织中的水分或丙酮吸收空气中的水分影响吸光度(Porra,2002)。该法最早由Mackinney(1941)提出,后经Arnon(1949)解释和推导。这种简易快速的一步提取测定法革新了最早的叶绿素皂化测定法,简化了操作过程,半个多世纪以来一直被奉为经典,因而被广泛应用。但由于当时技术条件的限制,Arnon法无论在吸收波长还是计算公式方面均有很大误差。随着实验手段的改进,Arnon法被不断修正,后来的研究者提出了越来越精确的测定方法和计算公式。但是目前大部分文献仍沿用最早的Arnon提取测定法,对后来的精确测定法关注较少。其原因可能是大部分研究者没有意识到Arnon法的缺陷,或者大部分研究只需要对叶绿素a与叶绿素b相对定量。不过在光合色素蛋白复合体的色素组成研究以及植物的光适应等研究方面则需要精确的叶绿素含量和叶绿素a与叶绿素b的比值(Porra,2002)。无论哪种研究,精确的测定方法对实验结果的分析都是有利的。本文对Arnon法及其改良方法存在的问题进行了总结,并提出了一种新的快速提取和精确测定方法。首先,已往推导的叶绿素浓度计算公式不准确。Arnon在推导叶绿素含量计算公式时出现了明显的错误,算错了吸光度A其次,叶绿素测定结果偏低。丙酮提取法大多仍采用研磨提取,不仅需要经过称重、研磨、洗涤、过滤及定容等繁琐的操作步骤,而且植物材料和试剂的用量也较大,不适合测定大批样品(张其德,1985;舒展等,2010)。更重要的是,研磨法并不能将叶片中的色素完全提取,提取容器、研钵和滤纸等黏附(残留)的叶绿素会造成待测样品的叶绿素大量损失,提取测定过程中也容易造成叶绿素降解,最终导致叶绿素含量测定结果偏低(张其德,1985;许大全,2009)。为此,舒展等(2010)改进并提出了叶绿素简化提取法,即绿色组织直接浸提法。这一方法大大减少了实验工作量,节省了试剂和植物材料的用量,但提取时间过长。第三,提取时间过长。大部分植物材料用80%丙酮常温浸提法完全提取叶绿素需要24-72小时,有的植物材料需要120小时以上。提取时间过长影响了工作效率,提取过程中也不可避免地出现叶绿素的降解(张其德,1985;Porra,2005)。为了快速提取叶绿素,有人提出用DMSO高温(65°C)提取叶绿素,可使浸提法提取时间缩短至数十分钟至2小时(HiscoxandIsraesltam,1979;Wellburn,1994),但大多套用80%丙酮叶绿素含量的计算公式,致使计算结果显著偏低(胡文玉等,1984;谭桂英和周百成,1987)。Wellburn(1994)建立了新的DMSO中的叶绿素浓度计算公式,但计算结果又明显偏高(王文杰等,2009)。由于DMSO具有黏稠、在低于19°C条件下易结晶、不易过滤、高温提取可能破坏叶绿素以及测定结果不准确等缺点,目前使用较少。本研究将DMSO和丙酮2种溶剂的优点结合起来,提出了先用DMSO高温提取,再用80%丙酮稀释叶绿素的两步快速浸提法。其中丙酮溶解叶绿素的能力较强,易清洗,但易挥发;DMSO则具有高极性、高沸点、热稳定性好、高温下不挥发及渗透力强等优点,且能与丙酮、乙醇、氯仿和水等溶剂互溶,被誉为万能溶剂,是高温提取叶绿素的理想试剂。将2种溶剂的优点相结合可降低DMSO的黏度、凝固温度和测定误差,加快提取速度。通过对提取温度、提取时间、稀释比例及吸收光谱等方面进行系统分析,筛选出提取叶绿素的最佳实验条件和准确计算叶绿素含量的公式,并用多种植物材料验证了该方法的可行性。1材料和方法1.1测定叶绿素的种类本实验选用菠菜(SpinaciaoleraceaL.)、油菜(BrassicacampestrisL.)、小麦(TriticumaestivumL.)、油松(PinustabuiaeformisCarr.)和毛白杨(PopulustomentosaCarr.)5种植物的叶片为实验材料,筛选和分析叶绿素的提取与测定条件,比较两步快速浸提法与Arnon法及其修正方法的优缺点。1.2提取方法1.2.1直接提取物法以下简称提取物法1.2.2研磨法称取植物材料0.5g,置于研钵中,加入少许CaCO1.2.3dmso-活化法取50-100mg植物材料,切成1mm左右的细丝或细段,置于10mL具塞试管中,用2mLDMSO浸泡,在不同温度下提取至叶片完全褪色,然后用80%丙酮稀释并混匀。用分光光度计测定叶绿素含量。1.3叶绿素b在不同溶剂中的稳定性以色谱纯叶绿素a和叶绿素b(纯度>95.0%,Sigma:C5753,C5878)为标准物,将叶绿素a和叶绿素b用不同的溶剂(丙酮和DMSO)分别溶解稀释至适当的浓度,用双光束紫外可见分光光度计(TU1900,上海精密仪器仪表有限公司)进行波长(精度为0.05nm)扫描和吸光度(精度为0.001)测定。以最大吸收波长作为叶绿素的光吸收峰;若最大吸收波长是一个区间,取该区间的中间值作为吸收峰。1.4计算公式的修正通过对Arnon公式进行重新推算,证实了Arnon推导的叶绿素含量计算公式有明显的错误和误差。大量实验数据证明Porra等(1989)的修订公式最为合理可靠。80%丙酮中叶绿素总浓度均用该公式计算。2结果与讨论2.180%丙酮或丙酮直接提取物的问题2.1.1提取温度对挥发性的影响丙酮浸泡法提取叶绿素需要较长时间,常温下大部分材料需要2-3天。提取过程中丙酮易挥发,使测定结果产生误差。为分析80%丙酮和DMSO在不同提取温度下的挥发性,精确量取10mL80%丙酮或10mLDMSO置于具塞刻度试管中,盖上试管塞并用封口膜密封。用分析天平称量盛有溶剂的试管总重量W2.1.2%丙酮和总提取时间的确定取大小、厚度、色泽均一的菠菜、小麦和油松叶片。菠菜和小麦用直径为0.9cm的打孔器打取2片圆叶片,切成1mm左右宽的细丝,置于10mL具塞试管中。油松针叶切成1mm左右的细段,精确称取50mg于试管中。然后在每支试管中精确加入10mL80%丙酮,盖上试管塞,并用封口膜封口。分别在4°C、20°C、30°C、40°C和50°C下提取至叶片变为无色或白色。记录提取时间,每种材料每个温度做3次重复。结果(表1)显示,常温或低温下80%丙酮浸提菠菜、小麦和油松等植物叶片所需时间长达1-3天。虽然提高提取温度可以显著缩短丙酮浸提法的提取时间,但所需时间仍较长。如在50°C高温提取菠菜、小麦和油松等植物叶片的叶绿素所需时间分别为25.6、8.3和17.5小时。上述材料用2mLDMSO在65°C提取叶绿素仅需要0.5-2小时,大大缩短了提取时间。2.1.3叶绿素在80%丙酮范围内的吸收峰测定一种物质的含量一般以其特征性光吸收峰作为检测波长,在这一波长下干扰最少,检测最为灵敏。前人对丙酮(80%,v/v)中叶绿素a和叶绿素b的吸收峰测定结果各不相同,导致叶绿素含量的计算结果差异较大。目前精密的分光光度计已经普及,有必要也有条件测定2种叶绿素的精确吸收峰。将色谱纯叶绿素a、叶绿素b分别溶解至丙酮(80%,v/v)和DMSO中,然后用精度为0.05nm的分光光度计进行波长扫描。结果显示,叶绿素的吸收峰值不是一个点,而是一个区间。叶绿素a在80%丙酮中的吸收峰在663.3-664.1nm之间,也就是说在这个区间内叶绿素a的吸光度达到稳定的最大值,波峰区间中间值为663.7nm(图2A)。叶绿素b在80%丙酮中的吸收峰值区间为646.6-647.4nm,波峰区间中间值为647.0nm(图2A)。波长扫描结果证实Arnon法中的吸收峰误差较大(叶绿素a和叶绿素b的吸收峰分别为663和645nm),其中叶绿素b吸收峰误差达2nm。叶绿素在DMSO中的吸光峰与在丙酮(80%,v/v)中的差异较大(图2A,B)。叶绿素a在DMSO中的吸收峰区间为665.5-665.9nm,波峰中间值为665.7nm;叶绿素b吸收峰区间为649.7-650.5nm,波峰中间值为650.1nm。测定样品中,叶绿素a在663.0和665.7nm处的吸光度分别为0.893和0.934;叶绿素b在645.0和650.1nm处的吸光度分别为0.498和0.566。因此DMSO提取的叶绿素含量利用Arnon公式计算误差可达10%左右(胡文玉等,1984;谭桂英和周百成,1987)。Willburn(1994)测定的叶绿素a和叶绿素b在DMSO中的吸收峰分别为665.1和649.1nm,与本研究测定的吸收峰值有一定差距(图2B)。王文杰等(2009)证明用Willburn(1994)的方法计算得到的叶绿素浓度明显偏大,很可能与其吸收峰误差有关。2.1.4丙酮浸提法测定叶绿素在dmso中的稳定性的比较由于80%丙酮浸提法提取叶绿素需要时间较长,在提取过程中很可能会造成叶绿素的降解。分别以80%丙酮和DMSO为提取液,用研磨法提取菠菜叶绿素,过滤后分别稀释至合适的浓度,然后分装至10mL具塞刻度试管中,每管10mL,分别置于4°C、20°C和30°C恒温箱中避光保存,分别在0、24、48和72小时测定叶绿素含量(考虑到丙酮具挥发性,用图1中的数据进行校正)。每个温度设6次重复。以0小时的叶绿素含量为100%,计算叶绿素的降解量(图3)。结果显示,4°C、20°C和30°C条件下叶绿素在丙酮溶液中长期保存均有一定程度的降解,如3个温度下72小时分别降解了1.3%、2.7%和2.9%(图3A),因此丙酮浸提法测定叶绿素含量比实际结果偏低。叶绿素在DMSO中的稳定性好于丙酮中,20°C和30°C下保存72小时降解率不足1%(图3B),这与胡文玉等(1984)的报道一致。由于DMSO高温浸提法提取速度快,提取后立即测定,叶绿素降解会更少,可以忽略不计。2.22级快速浸泡法提取条件的筛选和优化2.2.1叶绿素a和叶绿素b在dmso和80%丙酮溶液中的吸收峰鉴于DMSO黏稠、低温易结晶及吸收峰偏离80%丙酮中的吸收峰值等问题,本实验用少量DMSO高温快速提取叶绿素后,再用80%丙酮稀释DMSO溶液的两步快速浸提法。为筛选2种有机溶液的最佳混合比例,将色谱纯叶绿素a、叶绿素b分别溶解至DMSO:80%丙酮(v/v)分别为0:5、1:4、1:1的混合溶剂中,调整至合适的浓度,进行波长扫描。每种溶液做3次重复。结果(表2)显示,在DMSO:80%丙酮(v/v)为1:4的混合溶剂中(以下简称1:4混合溶剂),叶绿素的吸收峰与80%丙酮中的吸收峰波长基本吻合,分别为663.2和646.8nm(表2;图4)。虽然叶绿素a和叶绿素b的吸收峰值分别相差了0.5和0.2nm(表2),但647.0和646.8nm及663.2和663.7nm处的吸光度差异极小(图2A,图4)。因此,1:4混合溶剂套用80%丙酮中的叶绿素浓度计算公式误差最小。2.2.2不同温度对dmso提取叶绿素的影响为分析不同温度下DMSO浸提叶绿素的速度,取色泽和厚度均一的菠菜叶片打取2片圆片,切成宽0.1mm的细丝置于10mL具塞试管中,精确加入2mLDMSO,将叶丝全部浸泡在DMSO溶液中,然后分别避光保存于30°C、40°C、50°C、60°C、65°C、70°C、80°C、90°C和100°C的恒温箱中,并立即计时。每隔10分钟观察1次提取效果,至叶片完全变白,记录提取时间。每个温度做3次重复。结果(图5)显示,随着提取温度的升高,DMSO浸提叶绿素的速度加快,如70°C时的提取速度比60°C快1倍多,仅需90分钟。但温度过高可能会引起叶绿素的降解。2.2.3叶绿素的降解为探讨DMSO溶液中叶绿素在高温下的稳定性,用DMSO室温下研磨提取的叶绿素,稀释至合适浓度后,分装至具塞试管中,每管2mL,分别置于30°C、40°C、50°C、60°C、65°C、70°C、80°C和100°C恒温箱中,保温3小时。每个温度做5次重复。保温结束后,加入8mL80%丙酮,混匀后测定663.6和646.6nm处的吸光度,计算叶绿素浓度(Porraetal.,1989)。以初始叶绿素浓度为100%,计算叶绿素的降解量。结果显示,在小于等于65°C的条件下保温3小时,叶绿素几乎不降解;65°C仅降解了0.1%,可以忽略不计。但在70°C、80°C和100°C下分别降解了0.5%、3.4%和6.7%,叶绿素降解明显(图6)。因此Hiscox和Israesltam(1979)选择65°C提取叶绿素是可靠的。2.3两步快速浸提法鉴于目前叶绿素提取与含量测定方法均存在问题,因此有必要建立一种快速提取和精确测定叶绿素含量的新方法。我们把丙酮浸提法和DMSO浸提法巧妙地结合起来,提出了先用DMSO65°C高温提取,再用80%丙酮稀释DMSO的两步快速浸提法。该方法避免了二者的缺点,同时发挥了二者的优势,提取叶绿素的速度大大加快(表1),叶绿素提取过程中损失很少(图3,图6),且DMSO在高温下不易挥发(图1B)。该方法操作简单,需要的植物材料和有机溶剂较少,同时还避开了DMSO的黏稠性缺陷,降低了叶绿素吸收峰与80%丙酮中吸收峰的误差(图2B,图4)。2.4正确测定和计算绿化物浓度2.4.1叶绿素a和80%丙酮的吸收系数两步快速提取法解决了叶绿素的提取问题,但如何精确计算叶绿素浓度需要详细论证。国内外文献中共查阅到6种采用80%丙酮提取叶绿素的浓度计算公式,这些公式中的检测波长和吸收系数各不相同,公式的可靠性以及采用1:4混合溶剂提取叶绿素能否套用这些公式还不清楚。本文测定的叶绿素在80%丙酮中的吸收峰与Porra(1989)修订公式中的吸收波长最为吻合(表2),只是本实验检测的纯叶绿素a的吸收峰大0.1nm(图2A),但吸光度完全相同(表3);叶绿素b的吸收峰则大0.4nm(图2A),但在646.6、646.8和647.0nm处的吸光度也完全相同(表3),均在波峰区间内(表2)。叶绿素b的吸收峰偏大(0.4nm),可能是叶绿素b中混有少量的叶绿素a的缘故。叶绿素a会显著影响叶绿素b吸收峰处的吸光度,如在叶绿素b的80%丙酮溶液中,646.6、646.8和647.0nm处的吸光度差异极小(图2;表3);但在C从2种叶绿素的检测波长和相应的吸光度差异看,Porra等(1989)的修订公式和Lichtenthaler(1987)的修订公式都比较合理,检测波长较为精确,但2个公式中的吸收系数有明显差异,其准确性需进一步分析。1:4混合溶剂中叶绿素的吸收峰和吸光度非常接近80%丙酮中,但套用80%丙酮作为提取溶剂的叶绿素浓度计算公式会产生多大误差还需要验证。为考察6种叶绿素浓度计算公式所得计算结果的差异,将色谱纯叶绿素a和叶绿素b用80%丙酮分别稀释至12.5mg·L从80%丙酮叶绿素溶液浓度的计算结果(表4)看,公式1、2、3、5计算得到的叶绿素浓度比实际值都偏高,而C2.4.2种色素同一种溶剂的检测波长叶绿素a与叶绿素b在1:4混合溶剂中的吸收峰与它们在80%丙酮溶剂中的吸收峰虽稍有差异(相差0.2-0.5nm)(表2),但每种色素同一种溶剂的3个检测波长(叶绿素a:646.6、646.8、647.0nm;叶绿素b:663.2、663.6、663.7nm)下的吸光度非常接近,误差只有0.001或没有误差(图2,图4)。表4的结果也显示C将1:4混合溶剂中标准叶绿素溶液(C公式7可进一步简化为将表4中1:4混合液的相应吸光度代入公式7可得C2.6两步快速浸提法dmso及叶绿素提取方法叶绿素含量测定方法虽然简单,但只有注重细节且严格操作才能得到可靠的结果。精确测定叶绿素含量需注意以下事项,这些注意事项亦适用于丙酮浸提法和其它溶剂提取法。(1)每种处理建议做5次或以上重复,取材要均一,以增加实验结果的可靠性和稳定性。(2)植物材料切成1mm宽的细丝或细段,过粗提取速度慢;过细则会导致刀片和砧板沾染叶绿素过多,造成叶绿素损失。(3)65°C高温浸提时要将植物材料全