鸡马立克氏病病毒研究进展

鸡马立克氏病病毒研究进展

马齐克病（md）是马齐克病毒科的一种常见的流行病。它以淋巴组织的增生和肿瘤形成为特征，并在外周神经、腺体、粘膜、各种器官、肌肉和皮肤上形成单核细胞浸润。MD在临床上引起肿瘤和死亡的同时,更重要的是损害感染鸡的免疫器官,造成免疫抑制状态,导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答,引发其他多种疾病的并发和继发感染,造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)已将MD归为动物B类传染性疾病。该病是第一个能用疫苗预防的肿瘤性疾病,因此受到了医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。到目前为止,还没有有效的方法来治疗MD患鸡,但能通过疫苗预防控制该病的发生,所以对MD疫苗一直是国内外众多学者研究的热点。1mdv基因组突变MDV是一种细胞结合性病毒,分为三个血清型:I型为致瘤的MDV;II型为不致瘤的MDV;Ⅲ型为HVT。病毒核衣壳呈六角形,85~100nm;带囊膜的病毒子直径为150~160nm:羽囊上皮细胞中的带囊膜病毒子大小为273~400nm。MDV基因组为166~184kb的线状双股DNA,是一种典型的疱疹病毒,以往归于疱疹病毒亚科,近年来通过基因组排列和基因分析,MDV-1、2、3型的基因组酶切图谱均已建立,基因组的结构排列与简单疱疹病毒相同。在长独特区和短独特区的两侧均有倒置重复序列,故将其归于致瘤的疱疹病毒亚科。MDV基因组末端重复序列为E类排列,与人单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)基因组相同。MDV基因组很容易突变,最明显的证据是在常规减毒试验中,经过一系列培养细胞传代,病毒基因组可发生突变,导致病毒致瘤性减弱、A抗原丢失、在体外复制加快、返回体内后效价降低、溶细胞感染力下降、在淋巴细胞内失去复制能力、由羽毛囊内向外排毒减少、水平传播能力也随之下降等。韦平等利用设计的引物及设定的PCR反应条件,从所有的标准参考毒株及中国野毒株模板DNA样品中均扩增出与预计大小(1.1kb左右)相符的目的产物。但DNA序列比较却表明:MDV-1不同型的meq基因序列相对比较保守。它们相互间核甘酸的同源性均在95.6%~98.8%,两个疫苗毒株CVI988/Rispens和814均缺失了meq基因ORF中的第575~577位的3个碱基(CAC)。而属强毒株的GA株(vMDV)、648A(vv+MDV)、中国的两个野毒株N株和G2株在这个位点则完全保持不变。此外,在其它位点的碱基也有一些随机的变异。在MDV的3个血清型中,仅有血清I型病毒(MDV-1)可致肿瘤,血清Ⅱ型(MDV-2)和血清Ⅲ型(MDV-3)均无致瘤性,而被用做疫苗来防治MD。Witter等提出,根据病毒的致病性或致瘤性可将MDV-1的众多毒株分成如下4种致病型:几乎无致病性或致瘤性的温和型(mMDV)、强毒型(vMDV)、超强毒型(vvMDV和特超强毒型vv+MDV)。在过去几十年中,虽然已从病理学、病毒学、生物学、免疫学和分子生物学的角度对MDV诱发的肿瘤作了大量研究,但MDV诱发淋巴细胞转化为肿瘤细胞的分子机制仍不清楚。根据分子病毒学研究,有3个基因被认为可能与MDV的致瘤性有关:由MDV基因组的BamHI-H片段中的132bp重复序列及由该片段转录产生的1.8kbRNA家族,38kd磷蛋白(pp38)基因和meq基因。另外还发现这3个基因对于维持马立克氏病(MD)肿瘤细胞系来说是必要因素,因为132bp、pp38和meq的转录子可抑制MD肿瘤细胞系MSB1细胞的增生。上述1.8kbRNA家族存在于致瘤性MDV中,这一基因家族在人工致弱的MDV中却被部分地切除了。在疫苗毒CVI988株中的132bp重复片段趋向于产生更多的拷贝。2mdv基因组整合MDV在易感鸡的发病过程可分4个阶段:早期溶细胞感染、潜伏期感染、后期溶细胞感染和免疫抑制、转化。无细胞病毒虽然存在于其它所有组织和细胞培养物中,但仅可从羽毛囊上皮分离到病毒,主要为细胞结合型。MDV-1通常由呼吸道侵入机体,但少见有在此复制的报道。由于MDV对淋巴组织有亲嗜性,首先见到的显著损害为淋巴器官,即脾脏、胸腺和法氏囊,在这些器官感染后2~3d可检测到MDV抗原,表现早期坏死性损害,包括网状细胞和淋巴细胞,特征为网状细胞增生和巨噬细胞及粒细胞浸润。随后胸腺和法氏囊萎缩导致免疫抑制。对淋巴细胞类群感染研究发现,B细胞可能是感染的靶细胞,尽管有少量T细胞在早期发生溶细胞感染。法氏囊切除的鸡缺失B细胞,不能在脾、胸腺引起溶细胞感染,因而肿瘤发生率低,从而证实了B细胞在早期发病中的重要性;MD发病的另一个重要方面是淋巴细胞感染,包括病毒、细胞相互影响及宿主相关因素决定的潜伏和转化,病毒复制作为潜伏的第一步首先受到抑制。在潜伏感染的细胞,每个细胞只有几个病毒基因组拷贝,但通过体外培养很容易诱导转录和翻译。转化细胞可有多个基因组拷贝,但培养后不进入复制循环。然而在许多转化的细胞系中,可有一定比例有效感染细胞。近年来,应用分子生物学方法,对比溶细胞感染中整个MDV基因组外延基因表达,在潜伏期只有少数基因组转录。采用荧光原位杂交(FISH)对潜伏感染的感染细胞MDV基因整合进行研究,在单个细胞系中,MDV整合位点位于大或中染色体端粒上或在小染色体上,而在某些细胞系中检不到病毒DNA,表明其含量很低;这些自由病毒粒子在细胞内含量不同,NTC-2和Cu12含1~3个分子,Cu40和Cu25有5~10个拷贝。而RP19和MSB1不含有自由病毒DNA,随后对成淋巴样细胞及用HSH在感染鸡原始淋巴瘤细胞的研究却显示了类似的染色体多位点随机整合。MDV基因组整合形式表明肿瘤形成的单克隆性质及从肿瘤细胞建立起的细胞系在体外增殖时能保持该整合形式。多数淋巴瘤已包含整合形式,但它们却检不到自由病毒粒子,淋巴瘤细胞分离培养后,很快可检出线性DNA,这表明激活的病毒来自整合阶段。虽然MDV整合过程还不清楚,但MDV基因组末端和宿主细胞端粒序列极为相似关系表明,特别由于端粒至少在某些染色体是极好的整合位点,可发生同源或相互重组。MDV可改变宿主细胞基因的表达,在整合位点作为一个插入诱变剂,导致产生一个转化的表型。3诊断出sdv3.1sdv的分离和初步鉴定3.1.1混合研磨法破碎细胞拔取病鸡的幼嫩羽毛,剪下羽髓丰富的毛根,并把毛根剪碎,称重后以1:10与0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液混合研磨。研磨彻底后在-20℃冻结,再经37℃融化,如此反复冻融4次,使羽毛根细胞破碎。再经12000r/min离心30min后,取其上清液,加入双抗,置低温冰箱中保存备用。3.1.2毛细管黄囊及绒尿囊膜传代检测取4日龄鸡胚,消毒后,在照蛋器的照射下画出气室和胎位,将气室向上放于蛋盘中,在气室中心钻一小孔,垂直刺入针头,注入经过处理过的病料0.2ml,用石蜡封口,放入孵化箱内孵化。18日龄收集病毒。用碘酊将鸡胚的气室部卵壳消毒后,直立于蛋盘上,用无菌镊子击破气室处并除去石蜡、卵壳膜和卵壳,用另一镊子撕破卵壳膜,夹起鸡胚,切断卵黄带,置于无菌培养皿中,用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜分开,用无菌盐水冲洗卵黄,然后轻轻夹起绒毛尿囊膜。观察绒毛尿囊膜病变后,剪碎,研磨,12000r/min离心30min,取其上清液,加入双抗,进行传代。传代方法如上。3.1.3孔口的打孔制备采用琼脂扩散试验鉴定病毒。抗原收获第7代绒毛尿囊膜,经过剪碎,研磨,12000r/min离心,取其上清液。琼脂板的制备用含有80g/L氯化钠的0.01mol/LpH7.2的PBS配制的10g/L琼脂溶液,置水浴中加温,使其充分融化后,经脱脂棉滤过,倒入平皿中,厚度为3~4mm,凝固后移入冰箱中备用。用打孔器在琼脂平板上打7个孔,其中央孔1个,孔径为4mm,外周6个孔,孔径为3mm,孔与孔之间为4mm。用注射器吸取抗体于中央孔中,用另一个注射器吸取抗原于1~6孔中,加抗原、抗体时,以加满不溢出为度。将加完样的琼脂平板加盖后,在室温静置片刻,待抗原稍微扩散而液面下陷后,平放于带盖的湿盘中,置于37℃的温箱中,于24、48、72h观察并记录结果。琼脂扩散试验在分离物的待测孔和阳性抗体孔之间出现了明显的白色沉淀线,并且完全融台,说明分离物中含有马立克氏病毒。3.2诊断方法的选择马立克氏病病毒(MDV)的分子生物学研究已有近30年的历史。琼脂免疫扩散、间接荧光抗体、ELISA、体外DNA分子间杂交技术及限制性内切酶(RE)核酸分析法等相继用于不同血清型的区分,以及不同血清型毒株间同源性的比较。但是,这些方法的技术要求高,费用昂贵,试验持续时间长。自20世纪60年代末以来,许多研究者对MDV的特异性诊断进行了广泛深入的研究,建立了各种MDV抗原和抗体的检测方法,并运用肿瘤细胞上特异性细胞表面标志进行鉴别诊断。亦有运用核酸探针技术进行斑点杂交和原位杂交检测MDV-DNA进行诊断的报道。多聚酶链反应(PCR)是一种在体外对特异性基因序列进行高效扩增的方法,与以往的病毒检测技术相比,该法具有敏感性高、特异性好、快速、简便等优点。卢春等合成了一对MDV-1特异性引物,进行了MDV-PCR检测的方法研究,结果发现,从MDV-1感染的细胞、血液和羽毛囊中都扩增出与预期目标相符的DNA片段,说明该法不仅能区分Md4天竺葵4.1常规md疫苗的类型MDV有I、Ⅱ、Ⅲ型三种血清型,利用这三种血清型制成疫苗,三种血清型疫苗既可单独使用,也可混合使用。4.1.1重组病毒疫苗这类疫苗是用MDV通过细胞培养连续传代而致弱的,疫苗所含病毒是细胞结合性的,只有保证细胞的完整性,疫苗才具有免疫原性。最早的I型疫苗是英国学者Churchill等研制出的HPRS-16/att疫苗,随后荷兰学者Rispens等将中等毒力的MDV株经鸭胚成纤维细胞(DEF)传代后获得无毒株,并研制成的CVI988苗,广泛应用于荷兰和其他国家。因为该毒株有扩散的特性并略微存在致病性,1990年以后英国才准许应用该疫苗。同期由CVI988衍生的疫苗称“克隆C”,据报道可有效抵抗超强毒MDV的感染,该疫苗只在短时间内在美国上市和应用,不久在该国退出应用。“814”株是我国哈尔滨兽医研究所于20世纪80年代研制的另一种疫苗,它可用代次广,抗母源抗体,性能稳定且安全。目前,常将弱化I型强毒株和DNA重组技术结合起来研究新型疫苗。4.1.2免疫免疫疫苗系一类自然筛选的弱毒疫苗,血清Ⅱ型MDV都是天然非致病性的,广泛分布于鸡群中,这种疫苗毒可通过接触传播,感染后第5周产生很强的免疫力。1988年江苏农学院的黄仕霞等分离出的Ⅱ型Z4弱毒株是国内惟一的Ⅱ型MD疫苗。这一血清型具有代表性的是SB-I株。制成细胞结合性疫苗,单独使用就能产生广泛的保护力,但对超强毒株抵抗力不太强,可与HVT疫苗合用,充分抵抗超强毒株。美国和其他一些国家有商品SB-I疫苗出售,英国没有,除SB-I外,目前应用的血清Ⅱ型疫苗还有s-24、301B/12。4.1.3鸡体内hvt疫苗此类疫苗是火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗,其代表毒株Fc-126是由美国学者WritterRL博士从火鸡群中分离出来的一株无毒力品系,对鸡和火鸡均不致病,在鸡群内不传播。接种这种疫苗的鸡体,细胞中的HVT能使机体产生抗体,但不能中和MDV。该疫苗具有干扰作用,它先于MDV侵入鸡体细胞,能诱发阻止肿瘤形成的抗体,防止肿瘤的形成和发展。这种疫苗广泛应用,可有效抵抗强毒。既有细胞结合性活疫苗,又有易于储存、运输的冻干苗,目前正在使用的疫苗有:HVTFc-126和PBTHV1C4。4.1.4血清型疫苗的使用自20世纪8O年代开始,由于MDV毒力出现了超强毒,世界某些地区单价苗免疫失败屡屡发生,因此有些学者提出多价苗战略,先后研制出二价苗和三价苗。WitterRL报道了三种血清型疫苗单独使用和合用时抵抗强毒和超强毒MDV株感染的试验比较,证实了多价苗的效力。在美国主要使用Ⅱ型和Ⅲ型组成的疫苗,即SB-l或301B、12+HVTFc-126,西欧则使用I型和Ⅲ型组成的疫苗CVI988+HVTFc-126,我国使用的二价苗有814+HVTFc-126、SB-1+HVTFc-126及Z4+HVTFc-26。目前,我国使用的三价苗主要由814+SB-1+HVTFc-126组成。利用几种血清型病毒协同保护作用,使MD造成的损失得以降低,但多价苗只能用液氮保存和运输,成本很高。4.2md合成疫苗多采用植生剂在正体中的应用在我国我国我国英随着生物学技术的发展及其在疫苗研究领域的广泛应用,科研工作者努力研究比天然弱毒组成的常规疫苗免疫效果好、成本低、使用方便的抗MD基因工程疫苗。4.2.1mdv、vvddv、rb1b感染发病的免疫机制研究禽痘病毒(FPV)是目前分子量最大的动物病毒,全长约300kb,是极具开发前景的载体系统。科研工作者研究发现MDV的糖蛋白gB具有良好的免疫原性,Chen及Ross等相继克隆并序列分析了MDVgB基因,发现gB编码的100ku的糖蛋白复合物可以激发抗MDV免疫保护反应,NazarianK等已建立表达gB的重组FPV,GA株gB蛋白具有很好的免疫保护作用,该重组病毒对MDV、vvMDV(超强MDV)、RB1B感染发病具有良好的免疫保护作用。YanagidaN等利用随机克隆的PFV的EcoRI片段作为体内重组的同源DNA序列,分别在痘苗病毒7500bp和103bp人工合成的Ps启动子控制下表达了MDVgB蛋白和pp38蛋白,并通过免疫荧光检测筛选出重组PFV。gB蛋白重组PFV,接种雏鸡可使鸡获得抵抗强毒攻击的免疫力,而接种pp38蛋白重组病毒无保护作用。在MDV疫苗研究中,除gB糖蛋白还加强MDV其他糖蛋白的研究,寻找更多的疫苗候选分子。陈志琳等首次以FPV中国株为载体,构建表达MDVgI基因的重组病毒,为研制gI-FPV疫苗奠定了基础,也为进一步研制抗MD多价组合基因工程疫苗提供了有效组分。痘病毒重组表达一些结构性和非结构性MDV1抗原已建立,但没能产生理想的保护,包括gC、gD、UL47、UL48和pp38。接种MDV1或SB-1,能诱导MHC-I限制性的细胞免疫反应,MDV1的gD或gC没有保护作用。但用FPV重组表达的MDVlgC,MDVlgB和MDVlgD抗原混合接种比起单独gB接种,产生加强保护作用。LeeLF等利用rFPVs表达MDV1的gB1,gE,gI,gH和UL32,当用Rfpv/gB1gIgEUL32+HVT免疫鸡时保护率达到94%。4.2.2以hvt为载体的重组疫苗HVT基因组可容纳25kb的外源基因,可以插入一些外源基因。用HVT重组病毒表达MDV抗原的优点是二者有交叉抗原反应,从而可以用大量的HVT蛋白来诱导免疫反应,HVT在雏鸡体内维持时间也长,比起FPV来能够长时间的表达MDV的抗原。RossL等使用HVT做载体,在TK基因区插入gB构建基因工程苗,虽然TK基因的破坏使HVT在细胞内繁殖能力降低,但这种低效价重组病毒比其野毒株的免疫效果好。重组HVT疫苗的一个重要特点是可以插入多个外源基因,具有多重保护的潜力,人们对此非常感兴趣,制成联苗使用,以预防MD和其他禽病。MorganRW等将鸡新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸苷酶(HN)基因分别插入HVT非必需基因Usl0,构建了NDVF-HVT和NDVHN-HVT两种重组体,它们能在细胞培养物上和鸡体内稳定而充足的感染,ND-VF-HVT重组体接种的鸡可同时抵抗NDV和MDV的双重攻击,由此可见,利用HVT为载体结构建多联苗是实际可行的,关键在于插入合适的外源基因。这个重组方法的成功主要依赖予鉴定出了HVT基因的适宜位点,而后插入不削弱鸡体中病毒复制的外源基因,从而产生了理想的表达。迄今为止发现的最适合的插入点是Us10基因片段,它与不知功效的HSVUsl0基因同源。ReddySK等又构建了表达NDV的F和HN抗原,MDV1的gC和gB抗原的HVT重组疫苗,输卵管免疫接种结果保护了SPF鸡全身性NDRB1B。此外,还建立了表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2抗原HVT重组苗,在HVT的g和UL13位点插入IBDV的VP2抗原产生重组疫苗,接种后防止了鸡法氏囊的萎缩。HVT多联重组苗的构建成功不仅可以抗MD,同时还能对新城疫(ND)、IBD等产生保护,具有广泛的开发前景。4.2.3mdv基因缺失菌株对基因缺失疫苗的研究是当前研究抗MD基因工程疫苗的另一方面。CantelloJL等用大肠埃希菌的LacZ基因取代MDVUs2基因,通过蓝白斑选择筛选重组的Us2缺失毒株。SakaguchD等也报道了用同样的方法构建了PK基因和D基因缺失的毒株,这两个毒株虽然能在单层细胞上繁殖,但失去了在体内的转化活性和致瘤潜力。PaceUe等将大肠埃希菌B-半乳糖苷酸基因(LacZ)插入到GA株构建插入突变株,这些突变株在细胞上生长速度低,感染的鸡早期溶细胞感染、死亡率、肿瘤发生率和水平传播均降低,但保留着致瘤性。WitterRL等将网状内皮组织增殖病毒(REV)和MDV1联合培养,在MDV1基因的优势部位可与反转录病毒LTR顺序整合,形成了MDV1突变体,在基因组的TR3整合REV的LTR基因令人瞩目,保留了引起急性感染的效力,却丧失了致瘤性,获得了突变体RM1。WitterRL等将REV的LTR序列整合在MDVJM株的IRS和US的连接区,尽管RM1造成法氏囊和胸腺的萎缩,早期免疫抑制,早期溶细胞感染及接触感染,但其免疫水平比其他致弱的血清I型疫苗高,作为抗MDV超强毒的疫苗是非常有效的。CuiX等用MDVGA株的pp38基因质粒转染已感染CVI988株的鸡成纤维细胞(CEF)获得了CVI988pp38磷蛋白的点突变株。以MDvGA的pp38替代了CVI988pp38同源物,使反向构建V基因缺失株成为一种可行的方法。虽然某些基因缺失可使病毒的毒力降低,但并不能使MDV致瘤能力完全丧失,而且基因缺失的同时使病毒在细胞内复制的能力下降,甚至达不到目前常规疫苗的保护水平,所以这种疫苗作为商品化应用,还要做进一步研究。这些结果启示,该方法是将来生产疫苗的一个有效途径。也许在MDV基因的别的区域插入反转录病毒会产生理想的突变体。4.2.4mdvd免疫疫苗核酸作为疫苗的概念最早是1990年由Woiff