口腔微生物分子生物学

口腔微生物分子生物学口腔微生物分子生物学第1页第一节分子遗传学基础口腔微生物分子生物学第2页一、生命主要遗传物质----DNA（一）对遗传物质认识什么是遗传物质？蛋白质20种氨基酸DNA四种碱基转化试验结果说明……口腔微生物分子生物学第3页口腔微生物分子生物学第4页（二）核酸组成、分布及基础化学结构核酸是一个高分子化合物，它基础单体是核苷酸。每一个核苷酸由三个别组成，一个磷分子，一个糖分子，一个碱基。依据核苷酸组成，核酸分为脱氧核糖核酸和核糖核酸。口腔微生物分子生物学第5页DNA与RNA区分糖碱基结构DNA RNA脱氧核糖 核糖腺嘌呤胞嘧啶 腺嘌呤胞嘧啶鸟嘌呤胸腺嘧啶 鸟嘌呤尿嘧啶双链 单链口腔微生物分子生物学第6页（三）DNA结构推衍Chargaff:T+C=A+G A=T G=CX线衍射：

DNA在两条链组成，相互平行口腔微生物分子生物学第7页口腔微生物分子生物学第8页口腔微生物分子生物学第9页二、DNA复制（一）DNA复制中几个概念1.复制子（replicon）

DNA复制是与细胞分裂相联络，主要表现在DNA复制起始就意味着将要进行下一次分裂。在DNA完成之前，下一次细胞分裂就不会开始。

一个单独DNA复制单位称为复制子。口腔微生物分子生物学第10页每一个复制子都含有一个复制起点序列，又称复制原点，也常含有一个末端序列，复制过程在此终止。复制是在起始阶段控制，一旦开始复制，就会继续进行下去，直到复制完成。口腔微生物分子生物学第11页DNA多聚酶种类DNA多聚酶Ⅲ是DNA复制主要合成酶。合成DNA还需要以下原因：DNA前体材料，四种脱氧核苷三磷酸Mg++存在一小段DNA或RNA分子3’-OH一个DNA模板DNA多聚酶另一个主要特征是含有3’→5’方向内切酶功效。口腔微生物分子生物学第12页（二）DNA复制方式1.半保留复制2.半不连续复制口腔微生物分子生物学第13页半保留复制口腔微生物分子生物学第14页DNA复制特点新合成子代DNA与亲代DNA完全一样，确保了遗传稳定性。口腔微生物分子生物学第15页半不连接复制引导链：5’→

3’方向DNA合成滞后链：3’→

5’方向，冈崎片段口腔微生物分子生物学第16页口腔微生物分子生物学第17页三、基因表示（一）RNA类型发卡环：-AUUCGGA……UAAGCCU-种类信使RNA（mRNA)核蛋白体RNA（rRNA)转运RNA（tRNA)口腔微生物分子生物学第18页(二)RNA生物合成——转录转录:在RNA多聚酶作用下，以DNA为模板合成RNA过程。1.转录模板和方向：有意义链：模板链（3’→5’DNA链）反义链：非模板链口腔微生物分子生物学第19页2.RNA多聚酶与开启子

开启子：能特异性地与RNA多聚酶结合，引发RNA合成。从DNA上特定起始序列（开启子）开始，至终止信号结束口腔微生物分子生物学第20页3.转录起始与延伸口腔微生物分子生物学第21页4.内含子和外显子概念原核生物：基因是连续DNA片段真核生物：基因由若干个不连续DNA片段组成。内含子：插入序列，它是位于基因内部，能够被转录一段DNA。但在转录后，与之对应那个别转录产物在拼接中被去掉了。外显子：基因中与成熟mRNA相对应DNA片段，它不但包含蛋白质编码个别，而且包含5’和3’末端不翻译前导序列和尾随序列。口腔微生物分子生物学第22页釉原蛋白基因表示示意图口腔微生物分子生物学第23页口腔微生物分子生物学第24页（三）蛋白质生物合成——翻译口腔微生物分子生物学第25页1.遗传密码遗传密码性质全部密码都是由三个连续核苷酸组成，相邻两个密码之间没有间隔核苷酸存在3个终止密码子UAA,UGA,UAG，起始密码子：AUG密码子含有吞并性通用性口腔微生物分子生物学第26页2.蛋白质生物合成——翻译蛋白质合成过程Ⅰ.氨基酸活化氨基酸结合至tRNA，即氨基酸活化，由氨酰-tRNA合成酶催化。氨基酸与tRNA结合后，由tRNA依据遗传密码子将氨基酸按次序排列合成蛋白质。

口腔微生物分子生物学第27页Ⅱ.蛋白质合成起始

蛋白质合成在核糖体上进行，核糖体由tRNA和核糖体蛋白质组成。在细菌中，蛋白质合成第一个氨基酸是甲酰化甲硫氨酸（fMet)。它与对应tRNA结合成甲酰甲硫tRNA，只有它才能识别起始密码并进入核糖体特定部位，从而开启蛋白质合成

AUG→甲酰化甲硫氨酸（fMet)口腔微生物分子生物学第28页Ⅲ.肽链形成和延伸、合成终止终止码UAA、UGA、UAGⅣ蛋白质合成终止终止密码子口腔微生物分子生物学第29页口腔微生物分子生物学第30页口腔微生物分子生物学第31页口腔微生物分子生物学第32页口腔微生物分子生物学第33页3.新生多肽加工

Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修饰Ⅲ.信号肽蛋白质向细胞外分泌口腔微生物分子生物学第34页四、基因表示DNA→RNA→蛋白质丰富生命现象口腔微生物分子生物学第35页五、基因表示调整最初从一个受精卵，在个体发育过程中分化形成各种细胞组织和类型，最终形成一个完整生物体。机体每一个细胞都有一套完全相同基因共同表示基因维持细胞基础结构、功效特异性表示基因红细胞产生血红蛋白B淋巴细胞产生抗体成牙本质细胞分泌牙本质蛋白口腔微生物分子生物学第36页口腔微生物分子生物学第37页基因表示调控原因动力细胞内细胞间或细胞与外界环境间关系改变。口腔微生物分子生物学第38页基因表示调整方式开启子强开启子与RNA多聚酶有较强结合能力，转录水平较高弱开启子则反之。口腔微生物分子生物学第39页基因表示调整方式调整蛋白作用

—负向调整

—正向调整口腔微生物分子生物学第40页负向调整（一）乳糖操纵子学说大肠杆菌乳酸代谢由三种酶完成β-半乳糖苷酶半乳糖苷渗透酶半乳糖苷乙酰化酶操纵子（operon）几个结构基因（Z）调整基因(i)操纵基因（o）开启子（p）口腔微生物分子生物学第41页（1）在无乳糖情况下，调整基因编码阻遏蛋白能够和操纵基因特异性结合，使RNA多聚酶不能结合半乳糖苷酶基因开启子上而无法转录，结构基因就被转录。（2）看成为诱导物乳糖存在时，乳糖能与阻遏蛋白特意地结合而改变阻遏蛋白构象，使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，因而，解除了对结构基因表示抑制，于是β-半乳糖苷酶、半乳糖苷渗透酶、半乳糖苷乙酰化酶等基因被转录，进而翻译。口腔微生物分子生物学第42页结构基因调控有正调控和负调控两类没有调整蛋白时操纵子内结构基因是开启，而调整蛋白出现后结构基因被关闭。这么调控称为负调控，如乳糖操纵子。没有调整蛋白时结构基因是关闭，而出现调整蛋白后结构基因转录开启，称为正调控，如阿拉伯糖操纵子。口腔微生物分子生物学第43页（二）Britten-Davidson模型该模型主要假定基因表示得分调整是经过控制系统来调整。新补充和修改一个特定激活蛋白能够控制含有对应接收位点许多结构基因表示，即能够控制一组基因表示。一个结构基因拥有不一样几个接收位点，每个接收位点受一个特异性激活因子识别，这么它能够作为不一样组组员而在不一样情况下表示基因表示调整能够经过感应位点控制不一样集成基因而到达。口腔微生物分子生物学第44页口腔微生物分子生物学第45页口腔微生物分子生物学第46页正向调整口腔微生物分子生物学第47页原核生物基因表示调整主要在转录水平口腔微生物分子生物学第48页真核基因生物调整多层次复杂性口腔微生物分子生物学第49页第二节分子生物学研究主要方法口腔微生物分子生物学第50页一、分子克隆材料与方法分子克隆：意为“无性克隆”是DNA分子无性繁殖技术。口腔微生物分子生物学第51页（一）限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列DNA水解酶。三种限速酶Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型Ⅱ型限制性内切酶含有以下几个特征特定识别序列，4~6个碱基对在识别序列内固定位置切割，切割后5’–端磷酸基因，

3’-端羟基基团切割后形成粘性或平齐末端口腔微生物分子生物学第52页口腔微生物分子生物学第53页（二）DNA连接酶催化DNA中相邻3’羟基和5’磷酸基团之间形成3’，5’–磷酸二酯键。T4DNA连接酶大肠杆菌连接酶口腔微生物分子生物学第54页（三）质粒概念细胞内独立于染色体外环状DNA，能自我复制，在细胞分裂时可伴随染色体分配至子细胞中。特点其上基因可借助宿主细胞转录、翻译系统得以表示分子~50000bp口腔微生物分子生物学第55页TpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-Tvectormap口腔微生物分子生物学第56页XhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P

A-PfragmentSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCIXhoISmaIT4LigaseA-Pfragment口腔微生物分子生物学第57页分子克隆中，构建质粒特点Ori区质粒复制起点Par区确保细胞分裂过程中，质粒能均匀分配至子细胞口腔微生物分子生物学第58页多克隆区人为构建，便于克隆操作。含有多个单一限制性内切酶酶切点。选择因子含特定基因，如耐抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因（lacZ），使克隆后便于挑选。口腔微生物分子生物学第59页有质粒载体在其基因组中含有一个大肠杆菌lacZ区段，此区段含有编码β-半乳糖苷酶基因lacZ。在诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）存在下，β-半乳糖苷酶能作用X-gal（5-溴-4-氯-3吲哚-β–D-半乳糖苷）形成蓝色化合物5-溴-4-氯靛蓝。当这种质粒转化无lacZ基因大肠杆菌时，因为质粒，因为….口腔微生物分子生物学第60页(四)噬菌体概念是侵染细菌、螺旋体、真菌等病毒。结构温和噬菌体和毒性噬菌体噬菌斑是分子生物学中主要DNA载体当前广泛使用噬菌体有λ-噬菌体，M13噬菌体，口腔微生物分子生物学第61页野生λ-噬菌体线状双链DNA分子在分子两端各有12个碱基单链互补粘性末端当λ-噬菌体DNA被注入寄生菌细胞后，会快速经过黏性末端互补作用形成双链环状DNA。这种由黏性末端形成双链区段，称为COS位点。λ-噬菌体DNA包含约61个基因，其中二分之一参加了噬菌体生命活动，这类基因称为λ-噬菌体必要基因另一个别基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体生命功效，这类基因称为非必要基因。口腔微生物分子生物学第62页野生型λ-噬菌体本身不适合于作为载体，需要进行改造。改造后λ-噬菌体载体含有在噬菌体非必要基因区制造多个单一限制性内切酶区，方便外源性DNA片段插入或取代。引进一些突变以改变噬菌斑颜色或形态，方便重组体检出，如β-半乳糖苷酶基因区等。经过一些基因突变形成安全载体，方便利用生物学防护等。口腔微生物分子生物学第63页（五）转化、转染、转导转化是指受体菌捕捉和表示质粒载体DNA分子生命过程。细菌种属及细胞壁结构差异，转化条件和过程均不一样。感受态。即使同一菌属中，各菌株到达感受态条件和时机也存在差异。氯化钙处理大肠杆菌以提升细胞膜通透性。转染专指受体菌捕捉和表示噬菌体DNA分子过程。口腔微生物分子生物学第64页转导是利用噬菌体颗粒为媒介，将外源DNA转移至受体菌并得到表示生命过程。口腔微生物分子生物学第65页口腔微生物分子生物学第66页二、分子克隆主要步骤1.基因文库建立变链菌gtf基因染色体切成一定长度DNA片段DNA连接酶整合至载体（质粒或噬菌体）载体转化至大肠杆菌每一个转化大肠杆菌含有一个重组质粒，所以就含数万段重组质粒，所以就含有数万段个、变链菌DNA。这数万段随机变链菌DNA片段，应该包含该变链菌整个染色体。这个大肠杆菌集合体因为含有整个变链菌染色体而被称为变链菌基因文库。口腔微生物分子生物学第67页2.目标基因筛选核酸杂交免疫学检测口腔微生物分子生物学第68页3.目标基因分析DNA序列开启子分析推测蛋白质一级结构推测蛋白质二级结构口腔微生物分子生物学第69页口腔微生物分子生物学第70页口腔微生物分子生物学第71页口腔微生物分子生物学第72页口腔微生物分子生物学第73页三、特异性核酸检测口腔微生物分子生物学第74页（一）核酸分子杂交1.原理：在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离在一定条件下，两股游离互补核苷酸可自行配对形成双股口腔微生物分子生物学第75页2.核酸分子杂交技术过程（1）探针制备（2）待测核酸处理（3）核酸杂交类型点杂交SouthernBlot口腔微生物分子生物学第76页（1）斑点杂交目标序列存在目标序列量口腔微生物分子生物学第77页（2）SouthernBlot电泳、转移、杂交确定分子量口腔微生物分子生物学第78页（二）聚合酶链反应PCR1.PCR原理口腔微生物分子生物学第79页2.用于PCRDNA多聚酶口腔微生物分子生物学第80页3.PCR中其它原因口腔微生物分子生物学第81页4.PCR应用口腔微生物分子生物学第82页DNA电泳可分离不一样分子量DNA口腔微生物分子生物学第83页口腔微生物分子生物学第84页

Ladder1234567891011121314Ladder对临床菌株第二次PCR扩增产物电泳图谱分析

Lane1~7:临床菌株S.sobrinus;Lane8~14:临床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW口腔微生物分子生物学第85页与龋病相关微生物定量检测方法细菌形态生化反应免疫反应分子生物学方法----分子探针杂交----RFLP----PCR唾液在与龋病相关微生物检测中应用口腔微生物分子生物学第86页在人类口腔中检出率很高茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间关系更亲密变形链球菌和茸毛链球菌唾液在与龋病相关微生物检测中应用口腔微生物分子生物学第87页套式PCR快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌.谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵.中华口腔医学杂志，，38：223-226唾液在与龋病相关微生物检测中应用口腔微生物分子生物学第88页套式PCR(NestedPCR)5′

3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′

ThesecondPCRproduct口腔微生物分子生物学第89页本套式PCR引物是分别依据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计内、外两套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

口腔微生物分子生物学第90页抽提细菌染色体DNA(Igarashietal.1996)----细菌----唾液PCR反应过程第一次PCR反应

预变性:94℃4min

变性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最终延伸:72℃5min

第二次PCR反应口腔微生物分子生物学第91页

abcdefghLadder12345678选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组(MutansStreptococci)染色体DNA为模板

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5口腔微生物分子生物学第92页

abcdefghLadder12345678选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1口腔微生物分子生物学第93页

Ladder123456第一次PCR灵敏度

变形链球菌S.mutansIngbritt数量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25口腔微生物分子生物学第94页

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR灵敏度