肺结核的医学诊断

1、肺结核一、疾病概述肺结核(pulmonarytuberculosis)是结核分枝杆菌引起的慢性肺部感染性疾病，占各器官结核病总数的8090.是世界上最重要公共健康问题之一。随着AIDS的流行、人口的流动、器官移植的出现以及免疫抑制剂的广泛应用，结核病的疫情呈明显上升，多重耐药结核菌的感染更为常见。据1990年WHO的调查，全球现有肺结核患者2000万人.每年新发病例800万1000万，结核病的年死亡人数高达300万。我国是世界上结核病疫情负担最重的22个国家之一，目前我国正积极推行全程督导短程化学治疗(directlyobservedtreat-mentshort-course，DOTS)，使

2、肺结核患病率明显下降，治愈率超过94，有效地遏止了肺结核的传播。【病因和发病机制】1.结核杆菌结核分枝杆菌是结核病的致病菌，其包括人型、牛型、非洲型和鼠型，其中人型结核分枝杆菌是最重要的病原菌。结核分枝杆菌细长可呈多种形态，无荚膜和鞭毛，抗酸染色呈红色，不易被乙醇脱色，故又称抗酸杆菌。结核杆菌属于兼性需氧菌，具有较强的耐受性，在干燥和潮湿的环境中能存活数月甚至数年，但对高热、乙醇或紫外线具有较好的敏感性。结核分枝杆菌主要由类脂质、蛋白质和多糖类组成，其中类脂质可引起组织坏死、干酪液化和空洞形成，蛋白可诱发皮肤变态反应，多糖类导致免疫应答。2.发病机制(1)结核菌阳性，尤其是痰涂片阳性的肺结核患

3、者是结核病的主要传染源。传染性的大小与痰菌的量呈正相关。飞沫传播是结核病的主要传播途径。所有人群对结核菌均有易感性，而婴幼儿、老年人、HIV患者、免疫抑制剂使用者、慢性疾病患者等由于免疫功能不完善或低下，更易感染结核菌。(2)人体感染结核分枝杆菌时.大部分病菌可被肺泡内巨噬细胞吞噬杀灭，部分病菌由于能抵抗溶酶体酶的破坏而存活，并在肺泡巨噬细胞内外生长形成炎性病变，同时沿着淋巴管到达肺门淋巴结，引起淋巴结肿大，构成原发综合征。(3)T淋巴细胞介导的细胞免疫是人体对结核分枝杆菌主要免疫保护机制。人体首次感染结核分枝杆菌后，巨噬细胞分泌多种炎症介质促使淋巴细胞和单核细胞聚集，形成肉芽肿。当抗原再次进

4、入人体.T淋巴细胞尤其是CD4+细胞可识别特异性抗原，增加细胞因子或炎症介质的释放，激活巨噬细胞的吞噬功能，提高其抗菌活性而达到保护作用。(4)原发性结核感染后有部分结核分枝杆菌遗留在潜在病灶中，在某个时期可再次发生结核病或再次感染结核分枝杆菌而出现继发性肺结核。当人体出现免疫功能受损、营养不良或抵抗力下降，临床症状表现明显。【病理】渗出、增殖和干酪样坏死是结核病特异性炎症的三种病理改变，可同时存在，相互转化。1.渗出在结核病初期或病变恶化复发时，局部血管通透性增加，组织充血水肿，中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞聚集、吞噬结核菌。当机体T淋巴细胞介导的细胞免疫功能形成后渗出病变转化为增

5、殖表现，如果机体超敏反应较强时，则转向干酪样坏死，形成空洞。2.增殖主要表现为类上皮细胞结节和结核肉芽肿，其中央可见朗汉斯巨细胞，外周有淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞浸润。结核结节可相互融合形成融合性结节。3.干酪样坏死机体超敏反应增高或免疫功能低下，渗出性或增殖性病变呈进展恶化，干酪样组织液化经气管排出，形成空洞。部分干酪样组织周围肉芽组织增生，围以纤维包膜形成结核球或纤维干酪灶。【临床表现】肺结核患者常缺乏特征性的临床表现，20患者可无症状或仅有轻微症状。全身症状表现为低热、盗汗、乏力、消瘦，食欲下降、体重减轻和月经失调。呼吸道表现咳嗽、咳痰或伴咯血、胸痛、呼吸困难等症状。部分患者有结节者性红

6、斑、关节痛、泡性结膜炎和结核风湿症(Poncet病)等结核变态反应表现。病变范围较小时一般无明显体征。当病变广泛或继发空洞形成，叩诊呈浊音，闻及支气管肺泡呼吸音。胸膜增厚或纤维化明显，患侧胸廓塌陷，肋间变窄，气管向病侧移位，对侧代偿性肺气肿。【肺结核分型】1.原发型肺结核为原发结核感染所致的临床病症。多见于儿童和青少年。原发病灶、淋巴管炎和肺门或纵隔淋巴结结核炎症在X线上表现为典型的“哑铃”样病变，称为原发综合征。2.血行播散型肺结核多为原发型肺结核发展而来，也可继发于肺或其他潜伏病灶中的结核菌进入血液引起。包括急性、亚急性和慢性血行播散型肺结核，多见儿童、青少年和免疫功能低下患者。急性型全身

7、中毒症状明显，胸片上表现为大小、密度、分布一致的“三均匀”粟粒样结节影。亚急性、慢性者则病变以中上肺野为主，分布及大小不等。3.继发型肺结核是肺结核的主要类型，包括浸润性、纤维空洞性和干酪样肺炎等。多见于成年人，好发于上叶尖后段和下叶背段，胸部X线可表现为斑片状、条索状阴影以及空洞、干酪样肺炎等表现。4.结核性胸膜炎包括结核性干性胸膜炎、结核性渗出性胸膜炎和结核性脓胸。常为胸膜下病灶蔓延所致，胸片上显示胸腔积液征象。5.肺外结核包括中枢神经系统、消化系统、泌尿系统、骨关节等全身的结核病，多由于原发感染时菌血症所致的病灶。【肺结核特殊类型】1.无反应性结核病又称结核性败血症。多见于严重免疫功能低

8、下患者，表现为高热、肝脾和淋巴结肿大，肺部阴影延迟出现.预后较差。2.支气管内膜结核表现为刺激性咳嗽或伴咯血、呼吸困难，痰找结核分枝杆菌阳性，可继发支气管狭窄、肺不张和阻塞性肺炎等。3.结核性风湿症又称Poncet病，是结核病的变态反应性表现。可见多发性关节痛或炎症样改变，皮肤上出现结节性或环形红斑。【并发症】1.咯血肺结核咯血多为渗出、空洞病变或支气管扭曲、变形或扩张引起，大咯血可引起窒息、失血性休克、肺不张、结核支气管播散和吸人性肺炎等严重合并症。2.自发性气胸胸膜下病灶或空洞破入胸腔，纤维灶或瘢痕组织导致肺气肿或肺大疱破裂以及肺间质的病变引起间质肺大疱破裂均可出现气胸、液气胸或脓气胸。3

9、.肺部继发感染肺结核空洞、结核性支气管扩张、支气管狭窄等是继发细菌、真菌感染的病理基础。【诊断和鉴别诊断】1.诊断根据患者全身结核中毒症状以及呼吸道的临床表现，结合典型胸部影像学、痰找结核杆菌等检查，诊断较为容易。但肺结核的临床和X线往往不典型，易与其他疾病混淆。凡遇到下列情况应考虑肺结核可能：反复发作或迁延不愈的咳嗽、咳痰，或呼吸道感染经抗炎治疗34周无好转；咯血或痰中带血；长期低热；体检肩胛间区闻及湿性啰音或于啰音；有糖尿病、免疫抑制性疾病或接受激素和免疫抑制剂治疗；渗出性胸膜炎或有开放性肺结核密切接触史；关节肿痛和皮肤结节红斑等变态反应性表现。2.鉴别诊断(1)原发型肺结核：支气管淋巴结

10、结核应与结节病、淋巴瘤、转移性肿瘤和纵隔恶性肿瘤等相鉴别。(2)血行播散型肺结核：应与肺部感染、细支气管肺泡癌、癌性淋巴管炎、肺间质纤维化相鉴别。(3)继发型肺结核：应与肺部感染、肺脓肿、肺囊肿继发感染、肺癌等相鉴别。3.诊断记录程序(1)按病变范围、部位、类型、痰菌情况和化疗史程序书写。如右上继发型肺结核，涂(+)，复治；左侧结核性胸膜炎，涂(-)，培养(-)，初治。(2)如有必要，可在类型后加括弧说明。血行播散型肺结核可注明急性或慢性；继发型肺结核可注明空洞或干酪性肺炎等。并发症、并存病和手术史可在化疗史后按并发症、并存病、手术史等顺序书写。4.相关辅助检查(1)胸部影像学：胸部X线检查是

11、诊断肺结核的重要方法，也是早期发现肺结核的重要体检手段，可确定病变的部位、大小、密度、形态、有否伴随空洞以及与周围组织的关系，判断病灶的变化和疗效。胸部CT易发现微小病变，更易显示病变的性质和变化，有利于肺结核的鉴别诊断，也可以引导穿刺、引流和介入性治疗。(2)痰结核分枝杆菌检查：是确诊肺结核病最特异性方法，也是确定治疗方案和判断疗效的主要依据。所有肺结核或可疑患者均需查痰(具体方法见检验诊断部分)。(3)结核菌素试验：结核菌素主要成分为结核蛋白，是结核菌的代谢产物。目前主要使用纯蛋白衍生物(purifiedpro-teinderivative，PPD)。将PPD5IU(0.1m1)注入皮下，

12、4872h后观察皮丘硬结直径的变化：5mm阴性反应，59mm弱阳性(+)；1019mm阳性(+)，20mm或1为耐药。绝对浓度法，含药培养基菌落数20为耐药。间接放射性同位素法，为Bactec450仪器所用，快速可靠。【特殊检验】1.结核特异性抗体：探讨结核抗体在结核病的诊断、鉴别诊断以及疗效观察中的价值。方法 通过对324例患者血清结核抗体和痰检的结果进行对比分析。结果 结核抗体检测的阳性率为4599，痰检的阳性率2469。(1)测定方法：酶联免疫吸附试验(ELISA法)、金标法等。(2)标本：血清、痰液。(3)参考范围：阴性。(4)临床诊断价值和评价：机体感染结核分枝杆菌后能产生特异性免疫

13、应答，包括细胞免疫(结核菌素测定)和体液免疫(结核抗体)应答。测定体液中结核抗体可间接反映结核感染的存在，可辅助肺部有结核病变、但直接痰涂片和(或)结核分枝杆菌培养阴性的肺结核诊断。活动性肺结核多为阳性，但免疫功能低下者为阴性。随着抗结核治疗时间的延长，血清抗结核分枝杆菌抗体水平逐渐降低，也可通过结核抗体水平来评估结核病的转归。(6)方法学评价及问题ELISA法：能做到快速、敏感、特异、简便，但其特异性、敏感性、测定方法仍受到许多因素的影响.而且阳性结果不能排除以往感染或非结核分枝杆菌感染、卡介苗接种等所致。胶体金法：操作简便，无需或仅需极小的操作经验即可完成，无需任何仪器，保存方便，通常在室

14、温下可以稳定保存一年以上，便携，现场检测，时间短，加样后5-10分钟可得到结果。金标法结核抗体试验(TB-DOT)：该方法是应用现代生物技术提纯结核分枝杆菌特异性外膜抗原，引进斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)原理，在定性检测的基础上，引进定量标准色谱卡技术，用于测定活动性结核患者IgG、IgA、IgM抗体的快速血清免疫学诊断，以及用于化疗后抗体滴度动态跟踪观察，具有灵敏度高、特异性强等特点，能在数分钟内完成检测。具有简便、快速、不需特殊仪器等特点，得到临床广泛应用。由于结核分枝杆菌是胞内苗，加上结核分枝杆菌的弱抗原性、属间和种间共同抗原决定簇的存在，其在机体内的免疫反应是以细胞免疫为主，感染后

15、的抗结核抗体滴度较低，而且抗体滴度与病情的相关性未得到充分阐明，它与细胞免疫镶嵌性、抗体产生的前缓和后滞作用、共同抗原决定簇的存在和由于种种原因产生的假阳性和假阴性使结核病血清学诊断一直未取得实质性进展。4）结核杆菌蛋白芯片检测：肺结核病的诊断主要为痰涂片抗酸染色镜检，痰结核菌培养法。患者无痰则无法检测，抗酸染色镜检阳性率低且影响因素较多，痰结核菌培养法耗时长且对早期感染不易检出。因此，实现早期诊断结核分枝杆菌感染及建立准确，快速简便的试验方法，即结合抗体检测成为了结核病诊断和鉴别诊断的重要方法，国内外相继报道了脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）,结核菌重组蛋白抗原38KD和16KD等在结核病抗体检测

16、中的作用，目前已经有的结合抗体检测试剂均为未纯化的结核菌液抗原，存在特异性差的缺陷。三种抗原均为结核杆菌特异性较高的抗原，存在于结核杆菌复合群中，具有较强的免疫原性，适用于血清学诊断。LAM是一种结核杆菌细胞壁的脂多糖成分，具有较强的抗原性，其检测的灵敏性较高。是其他分枝杆菌所不具有的或者其含量远低于结核菌，约有75%的人群感染结核菌后会产生针对LAM的特异性抗体。38KD抗原是引起人结核病的结核分枝杆菌含有的一种特异性蛋白质抗原。即使已经预防接种也不会影响检测结果。并且患者体内针对38KD的抗体与患者的感染程度有良好的线性关系。可以动态监测该抗体，用于结核病的治疗考核及抗药物的选择。16KD

17、蛋白仅发现与结核菌复合群中，在其他分枝杆菌不存在该抗原的基因，因而也不表达该抗原。而其他分枝杆菌感染不能诱导机体产生抗16KD蛋白抗体，且该抗原阳性对儿童结核病和肺外结核的诊断提供较好的信息。所以3个指标联合检测可提高痰涂片阴性者的检出率，提供不同情况的早期诊断结果。可鉴别痰涂片阳性者是否属于结核杆菌感染。但该实验的局限性在于仅用于血清样本的测定和对免疫力低下者无法检出。5）结核杆菌T细胞检测（TB-IGRA）：结核菌素皮肤实验(PPD)用于诊断感染和活动性结核病，阳性结果与患者当前或未来是否患结核病具有相关性。局限性在于在免疫抑制者，新近感染者，营养不良患者以及幼儿中，由于其机体的免疫应答减

18、弱，PPD实验会出现假阴性结果，导致其敏感度降低。由特异的T细胞释放的IFN-在结核病诊断中具有较高的敏感度和特异度。方法学评价及问题：评价TBIGRA与常用几种结核分枝杆菌检测方法的优越性。方法选择确诊肺内结核70例，肺外结核33例及体检正常人群30例为对照，分别采用TB-lGRA、TST（PPD）、结核抗体、痰涂片及痰菌培养等方法检测结核分枝杆菌感染，进行统计学分析评价。结果结核分枝杆菌感染者TBIGRA检出阳性率、敏感性、Youden指数（准确性）均比常规方法高，差异有统计学意义（P001）；正常对照组阳性检出率比常规方法低，差异亦有统计学意义（P005）。表明TBIGRA假阳性出现少，

19、准确性高，且对肺内、肺外结核的检测同样准确有效。结论TBIGRA检测肺内、肺外结核病简便、快速、敏感、准确有效，值得临床推广应用。与T-SPOT.TB的区别？应用人群：“菌阴”结核的辅助诊断对于图片和培养阴性的疑似结核病患者肺外结核的鉴别诊断结脑（儿童），骨结核，肠结核（与CD鉴别），结核性胸膜/胸膜炎（胸腹水待查的患者），淋巴结核等。免疫力低下/受抑制人群的结核筛查儿童结核病的辅助诊断高结核暴露风险人群的筛查2.结核分枝杆菌分子生物学检测(1)测定方法：PCR法、核酸杂交法等。(2)标本：痰液。(3)参考范围：阴性。(4)临床诊断价值和评价：结核分枝杆菌DNA检测具有敏感性高、特异性强、快速

20、、能检出低活力菌等优点，对早期尤其是痰结核分枝杆菌涂片或培养阴性的肺结核的诊断有一定的价值。由于结核分枝杆菌DNA检测的各种方法存在许多技术上的问题，还有待进一步的完善与改进，临床上还未广泛应用。(5)方法学评价及问题1)TB-DNA-PCR检查即结核分枝杆菌基因检测，其基本原理是利用DNA在体外反复“克隆”复制，在短时间内，DNA可复制到原来的百万倍。此方法具有快速、特异、灵敏度高的特点，但电泳法定性PCR易出现假阳性(污染及引物的特异性不高等引起)，限制了其临床应用。 荧光定量PCR技术，是利用荧光探针的高特异性和PCR扩增的敏感性相结合，真正实现了结核病的快速诊断。标本类型可为尿液，痰液

21、，脑脊液，抗凝血液，具有较高的敏感性和特异性，它具有快速(34h出结果)、灵敏(检出率可达到10条菌毫升标本)、特异性高的特点.相对常规定性PCR，减少了许多中间操作环节，减少了交叉污染机会，既可定性又可定量检测，阳性率达60以上。此方法不受抗结核药物的影响，这对已开始抗结核治疗，结核菌生长受到抑制或发生变异而导致培养阴性的结核病有重要的诊断价值，也可用于评价抗结核用药疗效。需要注意的是，PCR方法检测的是病原体核酸，不管结核杆菌是否为活的杆菌，PCR均能检出，因此，在经抗生素治疗一个疗程后，必须两周后才能做PCR检测，以避免临床假阳性。2)核酸杂交法是利用核酸探针，即能识别特异性核苷酸序列的

22、带标志的一小段DNA分子，根据DNA双链互补结合原理，检测标本中结核特异性DNA片段来诊断结核病，可以在数小时内完成鉴定。此方法技术复杂，特异性强、灵敏度高的理想核酸探针尚缺乏，如果结合PCR技术，将标本中的结核菌特异性核酸先进行扩增，再进行探针检测，就能更早期、灵敏、特异地检测到少量的结核菌的存在，为临床结核病的诊断与治疗开拓新的领域。3)除PCR、核酸杂交对结核分枝杆菌进行分子生物学诊断的方法外，还有碱基序列测定、基因芯片检测等分子生物学手段。如16srRNA基因序列测定，由于分枝杆菌的16srRNA基因序列是高度可变的，有种类的特异性，即不同种的分枝杆菌其16srRNA基因序列是不同的，

23、所以可通过测定16srRNA基因序列来鉴定菌种。基因芯片在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域呈现出广阔的应用前景，但要成为临床实验室普遍采用的技术，仍有许多问题急待解决，如：提高基因芯片的特异性；简化样品制备和标记操作；增加信号检测的灵敏度；高度集成化样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发。3.L型结核杆菌检查(1)测定方法：细胞壁染色法、L型分枝杆菌培养基培养法、分子生物学方法。(2)标本：痰液。(3)参考范围：阴性。(4)临床诊断价值和评价。1)凡能破坏肽聚糖结构或抑制肽聚糖合成的因素都可诱导细菌形成L型。结核分枝杆菌在体内外经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可

24、影响细胞壁中肽聚糖的合成，异烟肼可影响分枝杆菌的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，均可导致其变为L型，呈颗粒状或丝状。L型结核分枝杆菌是结核分枝杆菌生命周期中的一个重要环节，是结核分枝杆菌为了适应不良环境的一种保护性反应，其细胞壁完全或部分缺失，导致细胞壁中分枝菌酸也全部或部分缺失。2)L型结核分枝杆菌可在结核患者各种标本中检出。L型结核分枝杆菌的检查对诊断菌阴结核病有极其重要意义。临床上，细菌L型的主要意义在于细菌仍有致病性，而且是临床上感染漏诊的主要原因之一。(5)方法学评价及同题1)细胞壁染色法有其缺陷，其只能证明标本内存在L型菌，但不一定就是L型结核菌，培养法还

25、须经返祖才可确诊为L型结核菌，其费时太长。如能在做细胞壁染色及培养的同时，结合分子生物学方法来确诊是否为L型结核菌，将大大提高确诊的效率，而且会使L型结核分枝杆菌检测更加快速，符合临床需要。2)细菌L型需在高渗和营养丰富的条件下才能生长，细菌L型生长缓慢，无阳性发现可报告无L型细菌生长。3)细菌L型对抗生素的敏感性往往与原菌有所不同。4.结核杆菌耐药基因的检测(1)测定方法：直接测序法，单链构象多态性分析(SS-CP)及固相杂交法。(2)标本：痰液。(3)参考范围：阴性。(4)临床诊断价值和评价1)抗结核药物的应用，使得结核病得到控制和治愈，然而间断用药、不合理的用药、管理不善等致使结核分枝杆

26、菌不能及时被药物杀灭而产生耐药性。耐药结核病导致病程延长，死亡的危险性增加，传染性增加，已成为引起全球结核病急剧上升的原因之一，特别是耐多药结核病(mdr-th)的发生对结核病控制规划的实施构成严重的威胁。耐多药结核病是指至少对抗结核药物中异烟肼和利福平产生耐药的结核病。耐药性是通过结核分枝杆菌特有细胞壁降低多数药物通透性、结核分枝杆菌产生诸如-内酰胺酶的降解酶类和其他药物修饰酶两种途径产生的。通过基因的分析，染色体突变介导的耐药性是结核分枝杆菌产生耐药的主要形式，由于靶基因核苷酸的突变，形成错误的氨基酸顺序，影响了药物和靶位酶的亲和性，形成结核分枝杆菌对药物的敏感性下降或耐受。由于基因突变的

27、发生.有23以上的结核分枝杆菌菌株对多种抗结核药物产生耐药性。快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因类型，了解结核病患者的耐药状况，对指导临床的化疗和防止耐药菌株的播散是非常必要的。因为检测患者结核的耐药谱是治疗的必要条件，但普通的培养加药敏试验需要时间可达2个月，时间长，早期得到耐药信息对患者的治疗更有意义。临床标本经前处理后接种在改良罗氏固体培养基或改良罗氏的液体培养基进行直接(绝对浓度法)或间接(比例法)的药敏试验。这是传统的方法，也是应用最早、最为普遍的检测结核分枝杆菌耐药性的方法，也是判定其他检测方法时的参考标准13。该方法操作简单、经济、适用于经济欠发达地区使用，但是存在着检测周期长(68周

28、)、阳性检出率低、不易标准化、结果重复性不佳、费时费力等缺点，不能满足临床的急需。2)近年来研究证实：耐利福平主要是由于编码RNA聚合酶的rpob基因突变；耐异烟肼系与katg、inhamaba、ahpc基因突变有关；pcna基因突变是耐毗嗪酰胺酶药的主要原因；编码16srRNA的rrs基因和编码s12蛋白的rps1基因的突变与耐链霉素有关；乙胺丁醇耐药株与embab基因有关。耐多药是由于多种药物靶基因突变所致，少数耐多药分离株只有一个利福平耐药基因突变.可能只存在一个突变位点，也可能系检查技术所限，未能测出所有突变。(5)方法学评价及问题1)直接测序法：是鉴定突变的金标准.利用耐药区域PCR

29、扩增，PCR扩增产物纯化或克隆化取DNA片段直接测序，与标准敏感菌株的同一DNA片段比较，分析碱基突变的位置和分布。目前已应用自动化DNA测序仪分析临床分离的结核杆菌基因突变。第三代DNA测序技术通过现代光学，高分子，纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，可以直接读取序列信息。DNA序列分析法是一种直接、客观的检测突变的方法，但由于设备和技术条件限制了其广泛应用。该方法不仅能用于细菌基因突变的检测，而且能够确定其突变的部位与性质，是检测基因突变的决定性方法。PCRDNA序列测定简便、快速，约848 h即可完成，是最常用的测定方法。目前，DNA序列测定已作为从基因水平进行结核分枝杆菌耐药性测定

30、的金标准。但对每一菌株来说，要测定各种抗结核药物的所有已知突变部位，需多次反应，同时费用昂贵，因此其应用受到限制。故此法多作为评价其他方法的参考方法，或与其他方法结合应用。2)聚舍酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)：PCR-SSCP原理是单链核酸通过自身互补或分子内的相互作用形成折叠构象，单个核苷酸的突变可造成其构象改变，从而导致其在非变性凝胶电泳上迁移速度的改变，是检测单碱基置换和碱基缺失或插入的可靠而简便方法.比直接DNA测序容易进行，可作为检测的快速筛选方法，也是一种检测耐药性的有效手段。目前用荧光素标记PCR扩增产物而建立自动化SSCP分析法，可直接检测痰涂片阳性标本和B

31、actec阳性培养物中的耐药菌株，适用于大量标本的快速筛选。3)固相杂交法：根据结核分枝杆菌RFP耐药ropb基因突变资料，设计一组覆盖69bpropb高变区的寡核苷酸探针，包括结核分枝杆菌探针一个，覆盖69bpropb高度区的野生型探针5个，ropb突变特异的撵针4个。依次固定于尼龙膜上，然后与待测菌株ropb基因扩增片段进行杂交，根据杂交谱带判断有无突变及突变的类型。因采用多个撩针且固定于尼龙膜上形成多列，此方法又称为多列探针检测法(lineprobeassay，LiPA)。该方法可快速鉴定结核杆菌RFP耐药株ropb基因的突变，适合于临床标本的直接检测。现已有商品化LiPA试剂盒。4)反

32、向线性点杂交技术：用膜芯片检测结核分支杆菌对链霉素和乙胺丁醇的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可作为常规药敏方法的补充，用于指导开展早期，有效的临床化疗。检测速度快，数小时到一天时间就可以完成检测。缺点是受探针数量限制，与测序技术相比，反向斑点杂交技术就不能检测到所有可能的突变类型，也更不可能检测到新的突变类型；另外基因突变和耐药表型也并非是一一对应的关系；所以反向杂交技术只能作为快速检验的辅助手段，下一步将进一步扩大探针系列中的探针数量，更多检测结核耐药性位点。5. T淋巴细胞亚群(CD4+细胞CD8+细胞)目前T淋巴细胞较为明确的两个亚群是辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)。辅

33、助性T细胞是能够帮助B细胞分化成抗体产生细胞和放大细胞免疫应答的一个细胞群，表达CD4但不表达CD8。细胞毒性T细胞(Te)是能特异性溶解靶细胞的一个细胞亚群，表达CD8但不表达CD4。CD4分子可增强对MHC类抗原的结合，CD8分子增强对MHC类抗原的结合。临床检测CD4+细胞CD8+细胞可作为细胞免疫功能的评价指标之一。(1)测定方法：流式细胞仪测定、荧光免疫组化技术、酶免疫组化技术等。其原理是利用CD系统的单克隆抗体(MeAb)与外周血单个核细胞反应的百分率，可确定人T细胞亚群的分布情况。(2)标本：肝素抗凝血。(3)参考范围：CD4细胞阳性率为(45.7土5.3)；CD8细胞阳性率为(

34、27.95.0)；CD4+CD8+细胞比值为1.660.33。(4)临床诊断价值和评价：T淋巴细胞介导的细胞免疫是人体对结核分枝杆菌主要免疫保护机制。CD4和CD8细胞是结核病产生保护性免疫反应的主要效应细胞。在结核分枝杆菌感染的早期，活化的CD4和CD8细胞就向感染病灶转移和聚集，通过递呈抗原、参与结核结节的形成、溶解被感染的细胞以及直接杀菌等作用来控制结核分枝杆菌扩散和防止结核病灶的复燃。肺结核尤其是活动性肺结核，其外周血中的CD4+细胞百分率增加，CD8+细胞百分率减少，CD4+CD8+细胞比值增加明显。(5)方法学评价及问题 1)流式细胞仪(flowcytometer，FCM)是利用流

35、式细胞技术对细胞或颗粒进行快速分析的自动分析仪。近年用流式细胞仪测定T细胞亚群日益广泛，结果稳定，重复性好。2)荧光免疫组化技术、酶免疫组化技术等主要影响是荧光抗体应有较高纯度，否则易出现假阳性结果。试验中所用McAb和荧光抗体的最适工作浓度均应通过预试验选择。3)婴幼儿CD4+细胞数较高而CD8+细胞数较低，老年人CD8+细胞数下降，因而其CD4+CD8+细胞比值较高；男女性T细胞数及其亚群相似.但女性CD4+CD8+细胞比值高于男性。在分析结果时应对此加以考虑。 6. 分枝杆菌菌种鉴定基因芯片我国分枝杆菌感染11.1是NTM（非结合分枝杆菌）。结核和NTM有相似的临床表现，但对于不同药物敏

36、感性不同。所以关于NTM准确诊断的必要性是有必要的。传统菌种鉴定方法根据菌株生长速度，色素产生，光反应，生化反应等进行分群，烦琐费时，不利于指导临床诊断。反向斑点杂交法快速鉴定分枝杆菌菌种，旨在建立一种新的简便，快速，特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。基因芯片检测系统，可快速、准确检测临床样本中的分枝杆菌的菌种类型，具有检测周期短(整个过程只需1天)、灵敏度高、特异性强的优点，对于指导临床用药和治疗有重要的意义，可广泛用于临床分枝杆菌菌种鉴定试验。涉及用于分枝杆菌菌种鉴定的基因芯片检测系统，包括用于检测分枝杆菌属、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和偶发分枝杆菌的基因芯片和待测样品中以上菌种的16SrR