第五章分子生物学研究法基因工程

1、第五章 分子生物学研究法 八. 基因工程 基因工程的主要内容:从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 载体的选择, 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选 择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞。在寄主细胞中表达外源蛋白。第五章 分子生物学研究法 八. 基因工程 基因工程的基本操作程序的四个过程: 目的基因的获取 基因表达载体的构建 目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定第五章 分子生物学研究法 目的基因的获取 生物材料mRN

2、A限制性内切酶一定大小范围DNA片段cDNA反转录酶 基因组文库 cDNA文库 基因文库 p. 183人工合成获得目的基因DNAPCR1. 目的基因的获取第五章 分子生物学研究法 目的基因的获取 目的基因的获取:(RT)- PCR扩增基因文库化学合成法 DNA片段 cDNA片段基因组文库cDNA基因文库第五章 分子生物学研究法 载体构建 2. 基因表达载体的构建 1) 基因表达载体的选择 2) 目的基因与载体的连接 第五章 分子生物学研究法 载体的构建 图: EcoR I 和Pvu II 双酶切质粒载体 和目的基因及目 的基因与载体的 连接。* 这种连接方式称为 取向退火形成重组 DNA分子。

3、Pvu II载体末端载体末端目的基因插入的目的基因Pvu II第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 3.目的基因导入受体细胞 1) 原核生物的人工转化（细菌转化） 感受态 (competence) 细菌容易吸收外源DNA时的生理状态。 在自然界中不是所有细菌都能够吸收DNA 也不是任何生长阶段都具有吸收DNA的能力 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 研究发现： 细菌的感受态是可以诱导的，而且此时细菌摄取DNA 是非选择性。 可通过电击法或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂处理细 胞, 使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,容易接受外界 DNA, 这类细胞被称为感受态细胞

4、 (competent cells)。 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 原核生物的人工转化（细菌转化） 是指细菌的感受态细胞接收外源DNA而获得了新的遗传 性状的过程。 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 （1）转化方法 CaCl2转化法 用CaCl2处理受体大肠杆菌细胞得到感受态细胞。 操作方法: 感受态细胞 +带有目的基因的质粒载体在 42C, 处理1-2 min；然后冰浴中 2 min。 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 优点: 简单、稳定、可重复性高。 缺点: 转化效率稍低，每微克DNA产生106-107转化子, 不能转化大质粒载体(15Kb)

5、。 转化率: 吸收了外源DNA的细胞在群体中所占的百分率。 在日常实验中，是用每微克质粒DNA所产生的 重组子菌落数来表示。第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 电击法 (electroporation) 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使其处于感 受态, DNA分子可通过细胞膜上的小孔进入细胞。 优点: 操作方便、转化效率高, 每微克DNA可得到 109-1010 重组子 缺点: 需要特殊设备 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 2) 真核生物的人工转化 （1）植物细胞转化 Ti转化法 利用Ti或Ri载体 直接转移法 - 电穿孔 - 微弹轰击法（基因枪法） - 激光

6、微束穿孔法 - 多聚物介导法 - 花粉管通道法 - 微注射法 - 脂质体介导法第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 （2） 动物细胞转化 病毒颗粒转导法 磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 DMSO（二甲基亚砜）转染法 脂质体介导法 显微注射 基因打靶 电穿孔 第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 4. 目的基因的检测与鉴定 1) 原核生物转化子的培养与筛选 利用抗菌素抗性 基因或X-gal和 IPTG蓝白斑进行 选择。 转化子: 带有外源DNA的受 体细胞。第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 2) 原核生物重组子的鉴定 质粒DNA分离和纯化 双酶切片段重组法

7、 主要检查DNA片段的定向等。 DNA序列分析重组子: 带有重组DNA的受 体细胞。第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 实验室一般使用下列两种方法制备质粒DNA： 氯化铯-EtBr密度梯度离心法 碱裂解法 质粒DNA分离纯化第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 氯化铯-EtBr密度梯度离心法 氯化铯的作用：离心的介质， 密度为 1.78g/cm2 离心平衡后，形成离心梯度1-1.9052g/cm3 EtBr的作用： 可插入DNA分子。第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 在细胞裂解和DNA分离过程中： - 细菌的染色体DNA分子质量比较大, 很容易断裂成线性片

8、段，插入的EtBr多，密度降低； - 质粒DNA分子质量小, 结构紧密, 在分离过程中不易断裂，吸 附的EtBr少，密度大。 利用这种差异来分离和纯化质粒DNA。 第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 石蜡油 蛋白质 松驰形或线形DNA (染色体DNA) 封闭环形的质粒DNA RNA 图: 氯化铯-EtBr密度梯度 离心法分离质粒DNA 的基本原理和操作程 序大肠杆菌裂解液形成DNA-EtBr复合物形成密度差异离心染色体DNA片段质粒DNA在紫外灯下吸取cccDNA（covalently closed circular DNA） 第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 碱变性

9、法 (碱裂解法) 是目前质粒DNA分离纯化中常用的一种方法。 原理: 基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性差异 而达到分离的目的。 第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 - 碱性使DNA变性 - 变性后再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒 DNA - 染色体DNA不会复性，常常聚集形成网状结构,与变性 的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下去 - 用酒精沉淀法收集上清液中的质粒DNA。第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 双酶切片段重组法 主要检查DNA片段的大小和方向等。 DNA序列分析第五章 分子生物学研究 目的基因的检测与鉴定 2) 真核生物重组子的培养与筛选(添加抗菌素)图: 叶圆盘转化法转化植株第五章 分子生物学研究法 目的基因的检测与鉴定 真核生物重组子的鉴定 DNA分子检测：Southern杂交、 PCR扩增 转录产物检测: Northern杂交、反转录-PCR 翻译产物检测: 检测酶活性、Western杂交 如果表达载体中插入报告基因, 可根据报告基因的表达特 性进行检测。 常用的报告基因有 Lac、Gus等基因 作业二名