分子与基因工程实验七

1、分子与基因工程实验七第1页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一二、实验原理 农杆菌重组子中携带经改造的Ti 质粒（含有帮助T-DNA跳到植物染色体上的Vir 区）和包含T-DNA的双元载体pBinGUS，质粒pBinGUS上T-DNA上插入了报告基因（GUS）和卡那霉素筛选标记基因NPTII。 叶盘法转化是通过人为在烟草叶片上产生伤口，侵染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位，受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移。T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上。共培养可使T-DNA上携带的编码抗生素的抗性

2、基因得到表达，因此，转化了的烟草外植体可在含有相应抗生素的培养基上生长。第2页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一植物基因转化受体系统指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。具备条件：（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性第3页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一外植体的种类叶片、叶柄、子叶、子叶柄茎、花茎、块茎、茎尖分生组织根合子胚成熟种子第4页，共16页，2022年，5月20

3、日，9点50分，星期一第5页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一叶盘法转化双子叶植物以叶片作为外植体，在叶片上产生伤口，侵染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位;受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移。T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上。 第6页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一农杆菌与外植体共培养接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养过程称之为共培养。是整个转化过程中非常重要的环节。因

4、为农杆菌吸附，T-DNA的转移及整合都在这共培养时期内完成。第7页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一Events An event is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome.Conceptions第8页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一Transformation frequency Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus.Line Th

5、e seedlings from one transgenic cell, namely, one independent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones. Generation These transgenic seedlings are T0 generation seedlings, T0 generation mature seeds are T1 generationMeiosis or pollination is the boundary of differ

6、ent generations. 第9页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器 及吸头，无菌滤纸；材料：携带质粒植物表达(pBI121)载体土壤农杆菌LBA4404 烟草无菌苗试剂： YEB液体培养基（1升）： 酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0 MS盐： MS大量元素、微量元素、pH7.0； MS基本培养基： MS大量元素、微量元素、有机物， 3%蔗糖，0.8 %琼脂，pH5.8；第10页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一实

7、验步骤第11页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一1. 从平板上挑取含有pBI121的农杆菌LBA4404单菌落，接种于50ml YEB液体培养液(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28C振荡培养至OD600为；2. 4000rpm，室温离心10分钟，倒掉上清.3. 用MS盐溶液（pH7.0）重新悬浮菌体，侵染时采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。4. 在超净台上从烟草无菌苗上切下叶片,切去边缘和主要叶脉，切成0.40.6cm2大小；第12页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一5. 侵染：将切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟，取

8、出外植体置于无菌滤纸上吸去材料表面的菌液。6. 共培养，将侵染过的外植体接种在上铺一层滤纸的MS基本培养基，28C暗培养三天。7.外植体暗培养三天后，转到含有抗生素的分化培养基（MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ Kan 100mg/L + Cb 500mg/L）上，在光照为2000-10000lx，25C条件下进行选择培养。8. 三天观察一次，发现污染，立刻转入新的相同培养基中第13页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一第14页，共16页，2022年，5月20日，9点50分，星期一注意事项1烟草无菌苗上切下叶片后，注意迅速盖好封口膜。2严格控制叶盘在农杆菌菌液中的浸泡时间。3