代谢工程的应用

1、植物代谢工程研究进展概述植物次生代谢及其产物在植物与环境互作和整个生命活动中行使着重要的功能：它们可构成植物防御体系的一部分（单宁和棉酚等抗病虫化合物1，参与植物的逆境胁迫反应（如甜菜碱、甘露醇等）。棉花抗蚜虫机制的研究结果表明，次生代谢物（棉酚、单宁和黄酮类等）及其相关酶基因的时空表达和积累所造成的生化异质性是植物防御虫害的主要机制之一。一些次生代谢物（如花青素等）使花瓣产生各种色泽、吸引昆虫传粉，有利于植物繁殖。生长素等次生代谢物可调节植物的生长发育。此外，许多植物次生代谢产物还具有重要经济价值。25的临床药物都是直接或间接地来自于植物的次生代谢产物。植物次生代谢物还可用于生产染料、杀虫剂

2、、食品的调味剂及香料等。因此，对植物次生代谢进行遗传改良，以培育能够大量合成和积累目标次生代谢物的品种，受到科研工作者愈来愈多的关注。应用常规育种方法改良植物次生代谢已有成功的经验，富含芥子油苷的花椰菜品种的育成就是一例。芥子油苷被认为有预防癌症的功效，它是作为抗癌变的标识酶即苯酮还原酶的诱导物来起作用的。新育成杂交种在诱导此酶的能力上提高了100倍。然而植物次生代谢物种类繁多，生物合成途径也千差万别，应用常规技术改良植物次生代谢的遗传特性进展缓慢。随着对植物次生代谢网络的研究和认识的深入，以及分子克隆和遗传转化技术的飞速发展，应用基因工程对植物次生代谢途径的遗传特性进行改造已成为具有广阔应用

3、前景的研究热点领域。迄今，已建立的植物次生代谢途径基因修饰的策略主要有，导人单个、多个靶基因（例如编码目标途径限速酶的基因）或一个完整的代谢途径，使宿主植物合成新的目标产物；通过反义RNA和RNA干涉等技术减少靶基因的表达，从而抑制竞争性代谢途径，改变代谢流向和增加目标产物的含量；对控制多个生物合成基因的转录因子进行修饰，更有效地调控植物次生代谢以提高特定化合物的积累。目前，在基因水平上研究得最清楚的植物次生代谢途径是合成黄酮类及花青素的次生代谢途径。已经鉴定出许多具有重要医药价值的次生代谢物，如吲哚和异喹啉类生物碱等。植物次生代谢基因工程分类次生代谢产物（secondarymetabolit

4、es）的低产现象是制约细胞培养法生产植物天然产物技术产业化应用的主要瓶颈之一71。针对这一问题，国内外研究者从细胞系选育，培养条件优化，培养技术改进等方面进行了广泛的研究。然而到目前为止植物培养细胞中次生代谢产物的低产问题仍未得到很好解决。近年来，随着分子生物学等相关学科的快速发展，从分子水平上对植物细胞的次生代谢进行调控以提高次生产物的含量已成为国内外植物细胞代谢调控研究中一个非常活跃的领域，并被视为是解决植物培养细胞中次生产物低产问题的一条新途径t。人们尝试利用基因调控手段来调节植物细胞的次生代谢，如采用关键酶基因调控技术、转录因子调控技术等从分子水平上解决药用植物细胞次生代谢产物的低产问

5、题。植物次生代谢途径的基因工程主要有次生代谢关键酶基因工程及其转录因子或调节基因的基因工程两个方面。21次生代谢途径中关键酶的基因工程211基因的添加通过基因工程提高控制某一特定次生代谢物合成的限速酶活性或在植物中引入新的次生代谢物合成途径，可提高转基因植物目标次生代谢物含量或合成外源次生代谢物。前一种策略可通过强启动子与关键酶基因的嵌合转化，后一种策略往往采用次生代谢物合成途径中下游一个或若干个有关键酶基因的协同转化。例如，HMGR基因在烟草中的组成型表达，导致了甾醇环阿屯醇合成量的提高_1。1。将长春花的TDC连接组成型启动子再转人到长春花中，转基因长春花中色胺的含量有显著增加；将长春花中

6、TDC和STR的嵌合基因连接组成型启动子再转人长春花，转基因长春花培养细胞中萜类吲哚生物碱含量有所提高。将次生代谢物合成途径的下游关键酶基因转入目标植物，在植物细胞内存在反应底物时，外源基因的表达可使转基因植物启动新的次生代谢物合成支路。例如，将花生芪合酶(STS)基因转入烟草，使转基因烟草表达了STS酶活性，合成了白藜芦醇并使转基因烟草的抗病水平有了显著的提高。212基因的剔除对于部分不利于营养品质或加工品质提高的植物次生代谢物，可通过反义基因的遗传转化抑制其合成途径中有关基因的表达，减少植物合成特定次生代谢物，从而提高植物产品的品质。例如，通过反义基因技术，可降低饲料和树木中木质素含量，从

7、而提高饲料的饲用价值和木材的造纸质量和效益。22次生代谢途径中调节基因或转录因子的基因工程特定次生代谢物合成主要是通过其合成途径中的多个合成酶活性表达所决定的，这些合成酶的活性表达受到相应的转录因子及其它调控基因的调节，其中，转录因子对合成酶基因的转录激活是植物次生代谢最为重要的调节环节之一。转录因子通过激活植物次生代谢物合成途径中多个合成酶基因的表达，可有效地启动或关闭次生代谢合成途径，从而调节特定次生代谢物的合成。转录因子的基因工程是植物次生代谢遗传改良的有效途径，随着植物次生代谢调控机制的阐明，特别是随着调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和鉴定，转录因子基因工程将为人类开发利用植物次

8、生代谢物提供有效的手段。对于涉及多个基因表达的植物次生代谢，同时增强多个基因的协同表达是提高次生代谢物产量所必需的。次生代谢途径中多个酶基因的协同表达与这些基因调控序列中相同或相似的顺式作用元件受到相同的转录因子或调节基因的作用有关。因此，增强这些重要酶基因的转录因子基因或调节基因的表达，是实现增强多个基因协同表达的可行途径。目前已分离了多种有关次生代谢基因表达的调节基因或转录因子基因，为开展植物次生代谢基因工程开辟了新途径。例如，已从玉米中分离了Myb区域和bHLH转录因子基因R、B、C1和P,从拟南芥中分离了AN11、TTG1、PAP1等类黄酮合成的调节蛋白基因，从长春花中分离了ORCA3

9、(茉莉酸诱导型的AP2区域转录因子)17-181。将玉米的R和C1基因置于强启动子控制之下的转基因拟南芥中，花色素苷大量合成；ORCA3基因在长春花中的组成型表达，使生物碱合成途径中的酶的表达增强，导致了萜类吲哚生物碱合成量的提高。植物次生代谢的基因工程只有采取针对特定次生代谢物合成的限速酶多基因家族的特定成员并结合诱导型或发育、组织器官特异性启动子，才有可能获得预期的目标。通过基因添加，将多个基因共转化，在目标植物中开启新的次生代谢物合成支路是对植物进行次生代谢遗传修饰的有效途径之一；另一方面，植物次生代谢调节基因或转录因子的基因工程在强化植物特定次生代谢中也极具应用潜力。3反义核酸与RNA

10、干扰(RNAinterference,RNAi)技术反义核酸是指能够与靶DNA或RNA片断互补、结合的一段DNA或RNA序列，反义核酸技术即利用反义核酸关闭目标基因表达的技术。目前，应用该技术对植物次生代谢调控常常与关键酶基因技术相结合。在药用植物次生代谢调控过程中可以利用反义核酸技术关闭某个基因的表达或切断某个代谢分支，从而使合成代谢向预期目标转移。紫草中暗诱导基因LeDI一2是紫草宁合成过程中的关键编码基因，利用反义核酸技术将其表达抑制后会降低紫草宁的产量。尽管是对目的产物的负调节，但说明利用反义核酸技术对代谢途径进行调节是可行的。当然，由于植物细胞内反馈抑制等多种调节机制的存在，以及目前

11、药用植物功能基因组和次生代谢途径研究还不够深入，为利用该技术提高细胞中的次生代谢产物量，尤其是对细胞具有一定毒性的防御性次生代谢产物的量带来了一定的难度。RNAi是指特定的双链RNA分子使基因在转录或翻译阶段沉默的现象，利用RNA分子可以对基因表达进行调控。张荫麒122制用反义DNA或RNA片段导入亚麻植物毛状根中抑制肉桂醇脱氢酶活性，使分支代谢中木质素的合成受到抑制，而使主要抗癌活性成分5一甲氧基鬼臼素的含量提高。Allen等利用该技术使罂粟中的可待因酮还原酶(codeinonereductase,COR)基因家族沉默，阻断了阿片类物质的合成，同时导致可待因前体物质网状番荔枝碱(s)reti

12、culine大量累积，而番荔枝碱是治疗疟疾的有效成分。利用RNAi技术对药用植物细胞次生代谢途径中的目的基因进行调控，为一种新的分子调控策略。植物次生代谢物生物合成途径的基因修饰1生物碱合成途径的基因修饰3.1.1吲哚生物碱生物碱是含氮有机化合物中最大的一类次生代谢物，主要包括异喹啉类、吲哚类和多炔类等，许多生物碱是药用植物的有效成分。Park等1已经证明罂粟细胞中的黄连素桥接酶具有反馈抑制作用，会减少苯菲啶的产量，但会增加多种氨基酸的产量。近年来科学家们已经开始努力研究吲哚类生物碱的生物合成途径，这些途径能合成具有重要药用价值的化合物，如具有抗癌作用的长春花碱和长春花新碱、喜树碱等。Whit

13、mer等z51将裂环马钱子苷添加到带有STRcDNA的转基因细胞系的培养物中，在低色氨酸脱羧酶(TDC)情况下，色胺合成速率高，只要有少量色胺存在即可提高裂环马钱子苷合成速率，同时诱导因子的添加也能提高总碱含量。将编码长春花TDC和STR的cDNA用CaMV35s启动子转人烟草中，TDC的活力基本不变，STR活力提高26倍，饲喂环马钱子苷后转化物中积累了异胡豆苷。3.1.2异喹啉生物碱黄连素、吗啡和可待因等异喹琳生物碱是重要的医用药物。对合成这类生物碱的次生代谢途径进行基因工程改良，经济价值更高。有关黄连素生物合成途径的研究发现，13种不同的酶参与从酪氨酸到黄连素合成过程。Frick等26】提

14、出了另一条遗传改良的策略，即通过对具有不同底物特异性的酶进行基因修饰，从而使植物能够合成新的生物碱。他们对块根唐松草0一转甲基酶亚基进行重组，使其形成异型二聚体酶，它的底物特异性与同型二聚体酶的底物特异性不同这一异型二聚体酶的表达，导致细胞合成新的生物碱。313莨菪烷生物碱和吡咯烷生物碱东莨菪碱和颠茄碱等莨菪烷生物碱是一类重要的药物，这些次生物质主要在茄科天仙子属、颠茄属、Dudoisia属和莨菪属等植物中合成。该生物碱代谢途径基因工程的主要目标之一是通过遗传修饰使植物本身能够将天仙子胺(Hyoscyamine)转化生成医药价值更高的东莨菪碱(scopolamine)(可用做镇静剂)。Jouh

15、ikainen等1将编码H6Hd的基因导入该植物，并使该基因在毛状根细胞中超表达，该转基因植物细胞系中东莨菪碱含量比非转基因植物细胞系中东莨菪碱含量高100倍，而天仙子胺含量在转基因植物根部和非转基因对照植株根部则基本相近。Zhang等(2004)在国际上首次利用基因共转化技术将PMT和H6H基因导入莨菪发根中，使转基因莨菪发根中东莨菪碱含量提高了9倍。32萜类化合物生物合成途径的基因修饰萜类化合物是异戊二烯单元(5碳)组成的化合物，通过异戊二烯途径(3Z称甲羟酸途径)合成，由2个、3个或4个异戊二烯单元分别组成产生的单萜、倍半萜和二萜称为低等萜类，单萜和倍半萜是植物挥发油的主要成分，也是香料

16、的主要成分，植保素很多是一些倍半萜和二萜化合物。萜类化合物虽然形态各异，但所有的萜类化合物都是从异戊二烯基二磷酸fIPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)聚合而成。将LIS基因导人土豆中，在水果特异性启动子的作用下能引起土豆中芳樟醇的积累。许多水果、蔬菜和鲜花的香味来源于挥发性萜类化合物，通过萜类代谢基因工程改良植物的香味也有成功的实例。此外，萜类代谢基因工程在提高植物抗性和增加一些药物生物合成方面也取得了成功。Wang等采用共抑制和反义策略敲除烟草毛状腺体中细胞色素P450单加氧酶基因的表达，结果导致了毛状腺体中萜类化合物组成的改变，双萜embratrieneol增加了19倍，使转基因烟草

17、对蚜虫的抗性也明显提高。Chen等1将来自棉花的法呢基二磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase,FDS)基因导人黄花蒿中，通向倍半萜生物合成途径的代谢流明显增加，导致抗疟类药物一青蒿素比野生株系高23倍。33黄酮类生物合成途径的基因修饰黄酮类化合物是一种小分子酚类物质，广泛存在于植物界，具有多种生物功能，如调节植物生长，保护植物免受紫外线的损伤和抗病虫等。花青素和黄酮类物质还具有较高的抗氧化活性，富含这两种物质的植物食品有利于人类健康和疾病预防。对这两条生物合成途径的研究比较清楚，其生物合成途径的改变能很容易通过花色的改变来鉴定oMuir等l321发现查尔酮异构酶(C

18、HI)是增加黄酮醇产物的关键酶。将查尔酮合成酶和黄酮醇合成酶基因导人番茄后，转基因果肉中黄酮醇类物质积累显著增加，表明应用基因工程技术增加番茄果实中有益于人体健康的化合物生物合成量是可行的。豆类植物的异黄酮是一类植物抗毒素，在植株受微生物侵染后，这些抵抗微生物的活性化合物可被诱导合成。正常情况下，拟南芥、烟草和玉米等植物缺少合成这类化合物的能力。Jung等将一种细胞色素P450单加氧酶一异黄酮合成酶的基因导入这些植物，使该基因超表达，这些转基因植物均能合成异黄酮类物质。因此，苯丙烷类代谢途径的基因工程可进一步应用于提高异源植物中异黄酮的生物合成。34醌和苯甲酸衍生物生物合成途径的基因修饰醌是从

19、苯甲酸衍生而来的环化合物，作为植物中的电子传递物起作用。植物中从苯甲酸开始的分别合成水杨酸、紫草宁和维生素E的代谢途径已经有被改进的例子。目前已经证实在拟南芥中可以增加维生素的含量，例如Savidgec等已经将拟南芥2,5一二羟苯乙酸异戊烯转移酶过度表达使普通植物中的维生素E的含量增加2倍。编码2一甲基一6一叶绿甲基萘醌甲基转移酶和一生育酚甲基转移酶的拟南芥VTE3和VTE4基因的表达使转基因大豆的一生育酚的含量比原来增加了8倍，而维生素E的含量增加了5倍。35新的代谢途径代谢工程过去经常修饰或扩展寄主植物中已经存在的途径，但是目前已经有把基因工程用在全新的代谢途径中，以此来生产不同的产物的例

20、子。例如将高粱中的两个多功能细胞色素酶P450和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)葡糖基转移酶基因转到拟南芥中，产生含氰蜀黍糖。药用植物次生物合成关键酶基因的克隆在药用植物次生代谢网络中，一些关键酶基因表达水平对某些目的产物的生物合成水平有着重要的调节作用。将次生代谢途径中的关键酶基因克隆，重组后导入到植物细胞中，通过提高次生代谢途径中关键酶的活性和数量，增加代谢强度，提高目的次生代谢产物的产量。利用关键酶基因调控技术调控局部代谢途径中的某个限速步骤，对提高药用植物细胞中次生代谢产物的含量有一定效果，但也存在不足之处。首先，由于植物细胞次生代谢是一个复杂的网络，仅仅依靠增加代谢途径中一两个关键酶基因

21、的表达水平往往对产物的代谢流量增加作用效果有限3一91。其次，目前对许多药用植物次生产物的代谢途径研究尚不深入，因而克隆这类代谢途径中关键酶基因的难度较大，制约了该技术在药用植物细胞培养过程中的应用。近年来，药用植物有效成分的生物合成基因调控研究进展迅速，克隆了抗肿瘤药物紫杉醇、长春花碱、抗菌药紫草宁、抗疟疾药青蒿素以及镇痛药吗啡等次生代谢物的生物合成相关酶的基因。应用功能基因组学方法研究植物次生代谢途径及其调控机理随着系统生物学的发展，后基因组时代的到来，人们更加注重功能基因的研究。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科，已成为后基因组学时代的一个非常重要的分支。代谢组学为研究

22、植物复杂代谢过程及其产物，分析植物次生代谢网络结构、限速步骤、解析细胞活动过程，以及寻找植物间的亲缘关系等提供了可能。将植物代谢分析的结果与转录组学、蛋白质组学和基因组学相结合将有利于建立基因和代谢产物之间的完整网络关系，从而为进一步全面阐明植物代谢规律及其关键步骤奠定基础。图1（略）所示为一种利用功能基因组学研究植物次生代谢途径及调控机制的方法，此方法是以大通量筛选和分析参与次生代谢的基因为基础的。从理论上说，该方法适用于任何植物或细胞培养物。最近对烟草细胞中尼古丁的生物合成代谢的研究验证了这个方法的可行性。用茉莉酸甲酯处理烟草细胞，比较分析处理后一段时间内cDNA扩增片断长度多态性转录谱和

23、目的代谢产物图谱。结果在2万个检测到的差异片段中有591个为诱导因子诱导转录的基因，其中58的基因具有已知的功能，包括了几乎所有已知的参与尼古丁生物合成的基因。对其余未知功能基因的研究将有助于阐明尼古丁生物合成代谢及调控机理14。Rischer等俐用该方法研究长春花悬浮培养细胞系萜类生物碱合成，获得了417个受茉莉酸甲酯调控的基因标签，分离出几乎所有的已报导的萜类生物碱合成途径相关的基因。植物次生代谢产物复杂，而且具有化学结构的多样性。这是利用功能基因组学方法研究次生代谢时遇到的普遍问题虽然应用功能基因组学方法研究植物次生代谢还有许多问题需要解决，但功能基因组学将会大大加速克隆参与次生代谢的酶

24、的基因，为应用生物技术提高植物次生代谢产物的产量奠定基础。植物成分化学结构的多样性比人类所建的任何一个化学库要多得多，植物作为一个巨大药物资源库越来越引起人们的关注。目前人类面临多种顽疾的威胁，如癌症、心血管病及多种传染性疾病等。由于合成化学的局限性，在植物次生代谢产物中寻找新药，也是制药产业新的希望。参考文献略基金项目：吉林省农业科学院博士后基金和博士启动基金资助代谢基因工程提高作物产量的分子靶标作者：qiusuo收录日期：2005-11-15发布日期：2005-11-15世界人口的增长，可耕地面积逐渐减少和农业环境的恶化，使得世界粮食安全问题日趋严重。常规育种技术所培育的优良作物品种，为解

25、决世界粮食问题做出了重大贡献。然而，近20年来各种作物产量均呈现徘徊局面，新育成的品种在产量潜力上没有大的突破，常规育种技术在继续提高粮食产量方面的潜力有限。基因工程技术的诞生和发展为作物进行遗传改良开辟了新途径。尤其是对一些质量性状的遗传改良，应用基因工程技术更有效。现今通过基因工程培育的抗虫、抗病、抗除草剂等作物（大豆，玉米和棉花等）品种已商品化。作物产量是一个复杂的数量性状，与植株的许多性状有关。以提高作物产量为目标的基因工程，显然要比单个质量性状的遗传改良难度大和复杂。尽管如此，随着生物技术的发展和对作物高产性状、高产机理及其相关基因的研究愈加深入，已相继建立了一些应用基因工程技术提高

26、粮食作物产量的技术策略。例如，雄性不育系的培育和杂优利用，改良作物对病虫及环境胁迫的抗（耐）性等。代谢基因工程的发展使得人们能够通过对植物细胞代谢进行遗传修饰而改变细胞本身代谢途径，以增加目标物质的积累或合成新的化合物。光合作用、淀粉合成、氮素同化和水分利用等是形成作物产量的基础代谢。近年来，对这些代谢途径中的关键步骤和靶分子进行基因修饰以提高作物产量的研究已取得长足的进步，拓展了有关植物代谢途径及其调控机制的认识。结合我们的研究工作，着重论述应用基因工程技术调控光合作用、淀粉合成、氮素同化和水分利用等代谢途径提高作物产量的技术策略和研究现状，以及这一研究领域所面临的挑战和应用前景。分子靶标的

27、确定作物产量是一个复杂农艺性状，与植株光合效率、养分吸收利用能力、物质转运速度和抵御饰的分子靶标是应用代谢基因工程培育作物高产品种首先要解决的问题。现在进行的许多植物转基因研究发现，对植物代谢进行有效调控是一道很复杂的工序。植物体内代谢不仅具有可塑性，而且各途径之间相互影响，错综复杂。因此，在确定基因修饰的分子靶标时，常需要考虑几个关键的问题。第一，某种代谢产物可能是不同分支代谢的底物，也可能是看上去并无联系的其它代谢途径酶的效应分子。这样，改变某一代谢产物水平可能会对整个代谢网络产生影响。第二，不同的酶可催化相同的反应，这使得植物能够补偿由于某个酶的遗传修饰而造成的代谢变化。或者说，即使通过

28、基因操作使某种目标酶表达量大幅度削减也不会给代谢带来明显的影响。第三，植物可以通过甲基化作用和RNA干涉等机制使导入的目标基因发生完全或部分沉默，从而阻止或降低了转基因对目标代谢过程的影响。依据对植物代谢途径及其调控机理的认识，通过对影响代谢产物分配的主要因素(酶基因及其调节因子)及其与作物产量关系的分析，已经确立了一些遗传修饰的分子靶标，这些基因参与淀粉合成、植物光合作用、N素吸收和同化、水分利用等植物生理生化代谢过程。对这些分子靶标的遗传修饰已进行了许多成功的尝试，使作物产量有了一定的提高，然而尚未达到所期望的程度。目前，以提高产量为直接目的的植物代谢遗传修饰主要集中在“源、流、库”能力的

29、改良方面，即：通过对“源”组织代谢的调节以增加其对“库”组织的碳源供应能力；通过提高“源”“库”组织之间同化产物的运输能力来促进光合产物向“库”组织的转运；通过调节“库”组织的代谢来增加其对光合同化物的利用效率，进而增加特定化合物的合成和积累量。淀粉合成的遗传修饰淀粉是禾谷类粮食作物籽粒和薯类作物块茎或块根中的主要储藏化合物，是人类食用碳水化合物的重要来源。全世界每年来源于水稻、玉米、小麦和马铃薯的淀粉超过109吨。增强作物储藏器官组织中淀粉合成和积累能力一直是常规育种和基因工程育种的一个主要目标。马铃薯具有丰富的适于转化的遗传资源，较易进行基因转化和获得大量的转基因株系。因此，马铃薯已成为人

30、们研究与产量相关代谢的生化特征以及代谢调控的模式植物。淀粉主要在质体中合成。葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)和葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)进入质体后，在ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶(AGPase)催化下，G-1-P和ATP形成腺苷二磷酸一葡萄糖(ADP-glucose)。ADP-葡萄糖是淀粉合成酶的底物和淀粉合成的前体物质。早期研究中，遗传操作提高淀粉合成的首选策略是增加ADP-葡萄糖含量。这可通过遗传修饰AGPase酶的特性来增加ADP葡萄糖的水平，也可以通过改变这种酶的已知变够效应物的水平，或者提高ADP葡萄糖上游代谢物己糖磷酸酯来达到此目的。这些遗传修饰策略虽然使转基因植株的代谢发生较大改

31、变，但其中只有对AGPase酶特性的遗传修饰后成功地提高了ADP-葡萄糖含量，进而使玉米籽粒和马铃薯块茎中淀粉合成和积累增加。Tjaden等和Loef等研究报道，质体中腺苷酸含量的水平对淀粉合成非常重要。马铃薯块茎中质体ATP/ADP转运蛋白的表达与淀粉含量的变化相关，质体ATP/ADP转运蛋白的过量表达导致了块茎中淀粉水平的提高。然而，对该转运蛋白的反义抑制则减少了块茎中淀粉积累。进一步发现，用腺苷酸溶液培养马铃薯块茎引起细胞中腺苷酸库增加，结果最终导致块茎中淀粉合成速率的提高。腺苷酸激酶催化ATP，AMP和ADP的转化，它是维持各种腺苷酸平衡的关键酶。因此，腺苷酸激酶就成为调控腺苷酸库大小

32、的靶标分子。Regierer等通过对质体腺苷酸激酶基因修饰而减低该酶的活性，结果导致转块茎中腺苷酸含量的增加。与非转基因的对照相比，转基因马铃薯株系块茎中淀粉含量增加了60，块茎产量增加39。不仅如此，转基因马铃薯块茎中一些氨基酸的含量也高于野生型马铃薯。这是迄今通过基因修饰技术使马铃薯块茎淀粉含量增加最多的一例，也是最成功的一例，并且建立了一种通过基因修饰调节参与目标代谢的辅助因子含量来增加产量的新技术策略。与常用的通过增加目标代谢产物的前体物质含量最终提高目标代谢产物产量的策略不同，该策略所修饰靶标是作为辅助因子的代谢物，这些辅助因子不仅参与目标代谢反应，还参与更多的其它生化反应。Smid

33、ansky，E.D等人近来报道了导人玉米shrunken2基因的转基因小麦的分析结果。玉米shrunken2基因编码葡萄糖焦磷酸化酶的一个大亚基，该亚基可降低其对负变构效应物正磷酸盐的敏感性。与野生型相比，转入该基因的小麦平均每株种子重量提高38。这可能是由于腺苷二磷酸葡萄糖含量的改变引起的，但是也不能排除该转基因对淀粉合成其它酶或代谢的多效性的影响。这种产量提高的原因被认为是由于淀粉合成的增加所带来的库强的提高。须注意的是，这可能是基因型特异反应的一个特例。因为许多已有的试验都表明，库强的提高未能自动地增加马铃薯的产量。另一个例子是，对线粒体途径的基因修饰出乎意料地增加了块茎中淀粉的含量，转

34、基因植株比野生型增加了45，但并没有影响到块茎的总产量。这些研究工作预示着，如果我们能够确定适当的遗传修饰靶标，那么通过代谢基因工程提高作物产量具有良好的前景。然而，由于现有分析工具的局限性，我们对转基因效应的阐述是有限的。通常情况下，仅能够对一些关键代谢组分的专一性遗传操作效果作出评价。例如，辅因子库等可调控多种复杂的靶标，作用于代谢途径的许多方面，对上述转基因马铃薯的块茎产量提高的解释就不能明确它是腺苷酸激酶活性降低的直接结果还是间接结果。对这些因果机制的准确认识的缺陷导致我们很难评价出对同一靶标的基因操作是否能在不同作物品种及种间产生相同的效应。光合作用的遗传修饰提高植物光合速率是光合作

35、用代谢途径基因修饰的一个主要目标。长期以来人们一直希望能将C4高光合特性导入C3植物以提高它们的光合效率。C4光合途径的关键酶即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)和丙酮酸乙磷酸双激酶(PPDK)。将C4植物玉米的PPDK基因转入马铃薯中，转基因植株的PPDK活性比对照高5.4倍。将整个玉米的PEPC基因转入C3植物水稻，获得了高水平表达玉米PEPC的转基因水稻植株，PEPC活性比对照高110倍。已有的大多数转基因植株的C4酶活性，虽然高于C3对照植株，但还是远低于C4植物中的酶活性。迄今还没有所获得转移C4光合途径提高产量的例证。看来C4酶只有与C4植物特

36、有的高效固定C02的细胞组织及路径相结合才能发挥其高光合效能。核酮糖-1，5二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)是固定C02反应的限速酶，改进该酶的活性尤其是对C02的亲和性，就能提高植株的光合速率。Rubisco由大亚基(rbcL)和小亚基(rbcS)组成。大亚基由叶绿体基因rbcL编码，小亚基由核基因rbcS编码。向日葵(Helianthusannuus)植物Rubisco的C02亲和性最高，比烟草约高10。将向日葵的rbcL基因导入烟草叶绿体，转基因烟草叶绿体合成了由8个向日葵大亚基和8个烟草小亚基组装成的十六聚体杂种Rubisco。杂种Rubisco对C02亲和性增加，但没有高到向日葵

37、Rubisco对C02亲和性，而且易于解体。所以这些转基因烟草植株光合效率没有提高。这可能是向日葵Rubisco大亚基和烟草Rubisco小亚基亲和性底的缘故。光合细菌Phodospirillumrubrum的Rubisco仅由一个基因rbcM,为同源二聚体。将rbcM导人烟草叶绿体，转基因烟草叶绿体没有形成杂种Rubisco，R.rubrum的Rubisco则大量生成，且具有原R.rubrum同样的C02亲和性。在C02富集的条件下，转基因烟草植株才能正常生长。这些对Rubisco进行分子修饰的探索为光合作用改进积累了经验。随着技术的发展，有可能将向日葵编码Rubisco大小亚基的基因全部导

38、入其它低光效的大田作物，使其产量提高。人们还对其它参与光合作用的酶及辅助因子进行基因修饰，以提高植物的光合效率。光合作用所固定的CO2经Calvin循环后要迅速用于合成淀粉等碳水化合物，才能保证光合作用顺利进行。加速Calvin循环产物通向终产物合成，就可提高光合速率。果糖-1，6-二磷酸酶所催化的反应正是光合产物离开Calvin循环进入终产物合成的分支点，因此，FBPase就成为基因修饰的分子靶标。将从蓝细菌分离的FBPase基因导入烟草，使其在叶绿体中表达。在含360ppmCO2空气条件下，转基因植株的光合效率和生长均明显提高，与非转基因对照相比，转基因植株的干物质和CO2固定率分别增加1

39、.5倍和1.24倍，Rubisco活性提高了1.2倍，Calvin循环中间产物及碳水化合物积累均比对照增多。这是第一个关于转基因表达单个质体靶标酶提高受体植株碳同化率和生长的报道，展示了通过转基因调控光合作用提高作物产量的可行性和有效性。氮同化的遗传修饰植物吸收氮的多少和氮利用效率高低对产量有重要影响。结合应用转基因技术和生理生化分析，人们对植物生长发育过程中氮吸收，同化和再利用的分子控制机理的认识愈来愈深入。谷氨酰胺合成酶(GS)，谷氨酸合酶(GOGAT)，谷氨酸脱氢酶(GDH)是参于高等植物氮同化代谢的主要酶。GS可分为两类，分别主要存在于光合组织的质体和根细胞的胞质中。质体GS由一个基因

40、编码，胞质GS由一个多基因家族编码。质体GS同化硝酸还原和光呼吸所产生的氨，而胞质GS主要同化植物根系统中硝酸还原作用产生的氨。GOGAT亦分为两类，其组成，分子量，还原特异性和功能明显差异。依赖铁氧还蛋白的GOGAT(Fd-GOGAT)，主要存在与叶组织细胞质体中，参与光诱导的生哩过程；NADH-GOGAT则存在于非光合组织中，与Gs一起同化铵。在铵的再利用中起重要作用的GDH，亦分为两种类型，即存在于线粒体的NADH-依赖型和存在于叶绿体的NADPH-依赖型。用玉米重组近交群体进行QTL作图发现，一些控制产量的QTL与3个胞质GS基因位于相同基因组区间，说明GS催化的氮同化反应步骤对产量有

41、重要贡献。现已对这几个酶进行了许多基因操作，以改进氮同化效率，提高作物产量。胞质GS在大豆根中超表达，总GS活性增加10%30%，总氨基酸含量明显提高，但植株生长和形态没有变化。大豆胞质GS在莲植物中组成性超表达，叶中总GS活性增加50%80%，根中GS活性则没变化，转基因植株发育加快，开花提前和早衰。若将大豆胞质GS在豆科植物根瘤中表达，植株茎和根的生物量提高2倍。烟草质体GS基因在大豆叶组织中超表达，导致转化叶中质体GS活性提高2倍，铵库量减少4倍，谷氨酸和谷氨酰胺含量增加。叶蛋白总量和表型没有改变。反义胞质GS基因在烟草韧皮部表达，植物体中胞质GS的mRNA减少20%30%，根和韧皮部铵

42、含量增加25倍，而质体GS和植株表型没有变化。超表达反义Fd-GOGAT基因的烟草，Fd-GOGAT活性降低60%，引起铵毒症。小麦的胞质GS1基因在植株体内铵的再利用或称中起关键作用，超表达GS1基因的小麦叶片，GS1活性增强，氮在体内尤其在籽粒中积累增多，根部和籽粒干重也提高，展示出小麦氮同化代谢遗传改良的良好前景。超表达各种GDH基因的转基因植物，不仅生长量提高，而且胁迫耐性也增强，进一步需在大田条件下，验证这些有利表型变化。可见，通过对氮同化代谢的遗传修饰提高作物产量还需作更深入的研究。水分利用率的遗传修饰在大多数情况下，水分利用率低是作物产量的限制因素，因此多年以来它一直是遗传改良的

43、靶标。改良植物细胞抗渗透胁迫的能力是提高植物水分利用率的一个可行途径。现已克隆了许多抗(耐)渗透胁迫的基因，对这些基因进行遗传修饰，提高植物水分利用率也已取得一定的进展。例如，海藻糖是一种可溶性的小分子化合物，在细胞中积累可提高渗透势，对蛋白质，膜系统有很好保护作用。将酵母催化海藻糖形成的基因海藻糖-6磷酸合酶基因TPS1在烟草叶绿体中超表达，海藻糖含量增加了20多倍，抗渗透胁迫能力增强，水分利用率也明显提高，这为进一步应用于提高大田作物抗旱性和产量奠定了基础。应用其它一些基因进行分子操作改良植物水分胁迫耐性也取得了不少成功的经验。未来需要进行更全面更复杂的生理生化研究，建立相应的技术体系，以使在实验室获得抗胁迫的植株能继续在大田胁迫条件下保持和遗传这种改良的特征。前景与展望通过代谢基因工程提高作物产量的潜力还尚未被充分认识和挖掘出来。虽然已有转基因提高作物产量的例证，但是目前仍然未能确定这些代谢遗传操作提高作物产量的真正机制。由于分析工具和水平的缺陷，基于目前的生化知识对这些代谢基