中药有效成分的分离筛选鉴定一体化技术与分子烙印技术

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减 中药有效成分的分离筛选鉴定一体化技 术与分子烙印技术 （作者：单位：邮编：） 作者：李剑勇，杨亚军，张继瑜，才学鹏 【摘要】应用现代科学技术研究中药有效成分，是中药现代化研究 的重要内容。利用分子烙印高分子制成亲和色谱柱，利用色谱分离技 术的高速高效性和质谱测定技术的高灵敏度和独有的混合解析能力，在 线连接HPLC-MS,可以直接从中药复杂体系中分离、筛选出有效 成分并 进行直接鉴定，实现中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化 技术。文 章简要从分子烙印聚合物及其制备、模板分子、功能性单体 及聚合条件 的选择、技术特点、应用状况及前景等方面简单介绍中草 药有

2、效成分筛 选鉴定一体化技术中最有应用前途的分子烙印高分子 技术。 【关键词】中药有效成分；分离筛选鉴定一体化技术； 分子烙印 技术 Abstract : It is an important aspect of modernization for Chinese traditional herb that active composition of Chinese traditi onal herb is studied withmoder n scie nee and tech no logy.Afi nity chromatography is preparedthrough molecu

3、larly impri nted polymers (MIPs). Based on high performa nee of chromatographic separati on tech no logy and highly sen sitive and special comb in atio nal an alysis ability of mass spectrogram, MIP-HPLC-MS is connected.Therefore, active composition from Chinese traditional herb may be separated, se

4、lected and ide ntified, which realized comb in ati onal tech no logy of separation, selection and identification for active composition of Chinese traditional herb. The mechanism of molecular imprinting tech no logy (MIT) and syn thetic processes of MIPs were in troduced in this paper. Application o

5、f MIT for separation, selection and identification for active composition of Chinese traditional herb were summarized, and the trends of MIT were also discussed in this paper. Key words : Active composition of Chinese tradational herb ; Comb in ati onal tech no logy of separati on, selecti onand ide

6、n tificati on ; Molecular impri nti ng tech no logy 随着科学技术的快速发展，现代药物的创制经历了由快速 低成本向研发周期延长、高成本的模式发展。为了加速新药研制的速 度，欧美制药公司不断地采用及开发先进技术。例如，采用组合化学 方法快速生产建立包含成千上万化合物的库；采用各种快速高效的筛选 检测方法去发现药物前体；将药物新陈代谢机理和毒性的研究提前到药 物发现这一环节来进行等。中药是我国的优秀特色医药遗产，其种类繁 多，历史悠久，实践证明对许多疾病疗效确实。因此，从中草药中创制 新型药物是切实可行又简捷的方法。 应用现代科学技术研究中药有效成

7、分，是中药现代化研究的 重要内容。经过几十年的努力，已经取得了许多重要成果，发现了大量 活性化合物，有些已经开发成新型的药物。事实证明，中药有效成分是 中药发挥治疗作用的物质基础。但到目前为止，仅有一百多种常用中药 的主要成分经过了比较详细的研究，大量中药及其成分仍有 待研究。研 究中药含有的有效成分，特别是对大量的中药进行活性成 分的研究，应 用高通量药物筛选的方法具有明显的优势，可以提高研 究速度和效率。 高通量药物筛选需要大量的样品，也可以借助新的样品制备方法和设 备，提取不同的样品，包括单一化合物、提取组分或 部位。同时积累各 种中药样品，建立样品库，供不同的筛选模型使用，提高样品的利

8、用 率。对中药单一化合物成分的活性筛选，可以根据获得的结果直接评价 化合物的生物活性和药理作用。但对于含有多种成 分的提取物或部位， 则可以根据活性结果进行跟踪提取分离，最终发现活性化合物或确定活 性组分1 。 将化合物分离鉴定手段与高通量药物筛选技术相结合，可以 直接对提取的组分进行分离和活性检测并鉴定，不仅可以节省研究费用，提高发现活性化合物的速度，同时也可以保证研 究目标的准确性。 基于分子识别原理，根据靶酶、分子烙印高分子及药物抗 体 与活性成分结合能力的差异，分别利用靶酶 分子烙印高分子及药物抗 体制成亲和色谱柱，利用色谱分离技术的高速高效性和质谱测定 技术的 高灵敏度和独有的混合解

9、析能力，在线连接HPLC-MS，可以直接从中 药复杂体系中分离、筛选出有效成分并进行直接鉴定，实现中药有效成 分的分离、筛选、鉴定一体化技术，其过程如图 1所示。 这是最近几年出现的药物筛选新技术之一 2。如利用细胞膜色谱法 筛选鉴定了当归、太白花、红毛七中的有效成分35;利用抗体 亲和 色谱柱筛选出抗丙型肝炎的先导化合物；利用分子烙印聚合物亲和色谱 柱成功筛选出抗肿瘤的EGFR抑制剂，实验证明活性化合物在这几种柱 中的保留时间与活性成正比6。 图1中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化技术（略） 由于MIPS具有较高的预定选择性，独特的化学、物理稳定 性，分子识别能力不受酸 碱、热 有机溶剂等

10、环境因素影响的优 点， 以及制备简单、可重复使用等特点，在分离 分析中展示了美好的应用 前景。下面从分子烙印聚合物及其制备、模板分子、功能性单 体及聚合 条件的选择、技术特点、应用状况及前景等方面简单介绍中草药有效成 分筛选鉴定一体化技术中最有应用前途的分子烙印高分 子技术。 1分子烙印聚合物及其制备 分子烙印技术，也称分子印迹技术（MIT）,其应用前提是 能够制备出具有分子识别能力的聚合物材料-分子烙印聚合物 （MIPS） o MIPS的制备过程大致为：将模板分子和功能单体按照一 定比例混合后在一定条件下反应，通过共价键或非共价键作用形成可逆 的模板分子-功能单体复合物；加入交联剂等，使之与

11、前面的模板-功能 单体复合物通过聚合反应形成多孔性的高聚物；将模板分子从高聚物 中抽提出来，这样在聚合物的骨架上便留下了一个对模板分子有“预 定”选择性的分子识别位。分子烙印聚合物中的空腔和模板分子形状、 大小完全一样，从而实现对模板分子的特异性识别。其过程见图2 :7。 根据模板分子和功能单体形成复合物时作用力的性质， MIPS分为共价型和非共价型两种。共价型MIPS制备过程中，模板分 子和功能单体通过可逆的共价作用，如形成可逆的硼酸酯和席夫碱。而 在非共价型MIPS生成过程中，模板分子和单体则可通过氢键、偶极、离 子 金属螯合、电荷转移 n-n共觇作用、疏水乃至范德华力等相互作 用形成复合

12、物。 图2分子烙印材料的制备过程示意图（略） 当这些微弱的相互作用在溶液中建立起来后，参与自组装的 分子自发地安置在液相溶剂中，聚合作用被引发，这些分子因高度的交 联聚合作用而在空间上被固定，然后将模板分子抽提移走，中间形成一 个空穴。用这种方法合成的MIPS检验模板分子和/或类似物 时，其扩散 进入分子烙印聚合物的互补位置，它们之间又能重新成键。 共价型MIPS中，单体模板所形成的配合物十分稳定，且相 互间存在着当量关系。因此分子烙印过程（即高聚物内客体键合点的结 构等）明确而清晰；由于共价连接的稳定性，因此可在较宽的聚合条件 下，如在高温，高或低的pH,或高极性溶剂中进行聚合。但是，单体-

13、 模板配合物的合成较困难，同时也不经济；可以采用的可逆共价联接体 系数目有限；在某些情况下，会因第3步剧烈的工作条 件（使共价键联 接断裂）而使烙印效果变差；客体的结合和释放都较慢，这是因为它们 都涉及键的形成和断裂过程。 非共价键型MIPS中，不必合成共价的单体模板配合物；因 为其之间仅有较弱的非共价相互作用力，可在温和的条件下将模板从聚 合物中除去，同时客体的键合和释出都有很快的速度。但是，烙印过程 的轮廓不够清晰，因为单体-模板加成物易于变化，而无严格的计量关 系；聚合过程的条件必须仔细加以选择，使混合物中非共价的加合物能 最大程度的稳定存在；由于在大量功能单体存在的条件下 （为使平衡有

14、利于加合物生成）常会出现非特征的键合点，于是体系 结 合底物的选择能力降低。对非共价键克仑特罗MIPS的液相色谱特 性的研究表明，在磷酸盐缓冲液/乙月青洗提条件下，其可以识别出其他所 有肾上腺素结构样物质8。目前绝大多数MIPS均是通过非共 价型 MIT制得的。 除了以上两种基本模式以外，还有一种将这两种模式综合在 一起的技术，即聚合时功能性单体与模板分子间的作用力是共价键，而 在对烙印分子的识别过程中，二者之间的作用力是非共价键。 Whitecombe 等9将胆 醇与功能性单体4乙烯基苯基碳酸酯共 价结 合后，用碱水解时随着C02的释去而打开了单体和烙印分子间的共价 键，此时MIP上便产生了

15、一个非共价型的分子识别位，在分子识别中通 过氢键结合胆固醇。用这种方法已经制备了体积较大底物（如药物分 子、类固醇、糖类等）的分子烙印聚合物，这些聚合物具有多位结合的 结构。 2模板分子、功能性单体及聚合条件的选择 MIPS形成中经过的两大步骤是两个相反的过程，它要求模 板 分子既能参加聚合反应，又能提取出来。作为模板的分子都应含有形成 弱相互作用力或可逆共价键的基团，能满足要求的化合物主要有糖类 （包括甘露糖、半乳糖、果糖）、氨基酸及其衍生物；蛋白质 核昔酸 及其衍生物；瞟吟、u密唳等生物碱；竣酸、二醛、胆固醇、维 生素 酶 神经递质如乙酰胆碱；杀虫剂、除草剂、染料 药物以及 重 金属等。

16、功能单体的选择主要由模板分子决定，首先必须能与模板分 子成键，且在反应中它与交联剂分子处于合适的位置，能使模板分 子恰好镶嵌其中。常用的功能性聚合单体有甲基丙烯酸（MAA）、 牛 乙烯苯基硼酸、毗唳衍生物、丙烯酰胺等等。一般认为矽M与氨基 之间可发生质子化作用，同酰基 竣基 氨基甲酸酯之间可产生氢键作 用。为得到稳定的模板-单体复合物，所选择的功能单体应与模板间存在 尽可能强的分子间作用力（如氢键 离子对作用等），因此对 含有碱性官能团（如氨基等）的模板应选择含竣基的功能单体（MAA 等）；而含酸性功能基团（如竣基 酚轻基）的模板应尽可能用碱性功 能单体如乙烯基毗唳。有时根据模板分子的结构，采

17、用与模板分子具有 多作用位点的功能单体，可使聚合物的选择性大大提高。此外，对某些 模板分子采用混合功能单体，亦能提高分子烙印聚合物的选择性。Jorge Luis 10 在研究氯霉素分子烙印时采用混合功能单体，二乙氨基乙基 丙烯酸甲酯（DAM ）与2-乙烯基毗唳摩尔比是25 : 75,混合功能单体 与氯霉素的摩尔比为2:1,在50 C条件下，制备的氯霉素分子烙印聚 合物，实验结果表明混合功能单体聚合物的烙印效果优于单一功能单 体；Wang等11 在研究氨基酸衍生物分子烙印时，2-乙烯毗唳和丙 烯酰胺的混合物为功能单体，也得到了类似的结果。 交联剂最常见的主要是乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、

18、季戊四醇三丙烯酸酯以及一些乙烯基衍生物，如二乙烯基苯等。 分子烙印过程主要通过自由基引发，其引发方式主要有高 温 热引发和低温光引发。具体的聚合条件选择则视具体情况而定，因 为影响反应的因素很多，如浓度、温度、光照及溶剂的种类和极性等。 常用的引发剂有偶氮二异丁腊（AIBN）、偶氮二异庚腊（ADVN ）等。 由于非共价作用的强弱强烈地依赖于溶液的极性，所以非 共 价方式一般选择在有机溶液如氯仿、甲苯中进行，而共价方式一般 选择在极性较强的水 醇等溶液中进行。 3分子烙印技术（MIT）的特点 3.1选择性高MIP依靠分子形状、大小及官能团进行分子识别，类 似于生物体系中酶对底物 抗体对抗原或受体

19、对抑制剂的作用，因止匕 其对模板化合物及其类似物（包括空间结构相似的化合物）具有较高的 选择性，在某些体系中，MIP的识别已优于传统方法制备的抗体，从而 MIP又被称为模拟抗体。目前，MIP作为分子识别材料，除了被用于手 性分离、免疫分析、传感器、模拟酶催化以外，在 相萃取（SPE）方 面的应用也越来越引起人们的注意。 3.2稳定性好与生物大分子（酶或抗体）相比，MIP具有制备简 单、周期短、性质比较稳定（耐酸、碱，耐高温、高压等）、可在 普通 条件下存放、能重复多次使用的优点 3.3药物筛选模型的替代性对有些疾病尚无筛选模型或所建立的药 物筛选模型繁琐危险性较高，可以以对该疾病防治确实的已知

20、药 物为模 板，研制MIP与高效液相和色谱联用技术作为高通量预筛模型的最佳替 代，前景广阔。 3.4应用范围广利用MIPS的选择性，用其作为吸附剂 可以实现对目标化合物的提取、 纯化和浓缩，使之达到能够被直接 检出 的浓度，从而降低检测限，提高分析的准确性和精密度，克服样品体系 复杂、预处理繁琐等不利因素，为痕量组分的富集和分析提供 极大的方 便。随着研究的深入，MIT与色谱、毛细管电泳、荧光、电分析法等分 析、分离手段结合，利用MIPS的选择性以及多孔性，在 药物分析、有 害成份检定、环境监测以及催化方面得到广泛应用。 3.5药物研发应用前景大MIP与高效液相和色谱联用技术可以在中 药研究开

21、发的如下四大领域应用2: 3.5.1寻找先导化合物以一种已知的活性化合物为模板合成相应的 分子烙印聚合物，可以将其用于合成的组合化学库或者天然组合化学库 中药体系（包括复方）,直接从构型多样的库中提取出来其他结 构类似 的先导化合物，从而避免了传统分离提取的非特异性和低效性。 3.5.2寻找已知药物替代品高活性的抑制剂在成为药物之前，必须 经过药理研究、毒性筛选等，许多有效的抑制剂往往因为高毒性或副作 用，或者在体内吸收不好而无法最终成药。而中药的毒性较小。若以某 种高效高毒性的分子作为模板分子烙印出来的聚合物, 可以直 接从这种天然组合化学库中筛选出来其他有效并且低毒性的化合物 作为 替代品

22、；或者某种高效无毒的药物分子由于合成困难而导致非常昂贵， 此时也可以用分子烙印的方法寻找其他成本低廉且容易得到的替代品。 3.5.3高效提取微量（或痕量）成分在中药的传统分离提取过程 中，许多有效成分往往因为含量低微而被漏筛或者难以纯化出来， 利 用分子烙印的强特异性和高选择性可以将一些含量很低的化合物直接从 粗提物中提取出来。 3.5.4制定中药质量标准中药在中国的应用已经有几千年的历史， 但往往由于其成分的复杂性和有效成分不够明确而难以在国际市场上被 认可。如果能够利用分子烙印的方法对某些有效成分的含量进行监控 （可以用色谱或者质谱的手段检测目标产物的存在及确定其含量），制 定一套质量标准

23、，将有利于中药的进一步应用推广。 4 MIT在中草药有效成分分离鉴定中的应用研究 MIP分离化合物的机制见图3所示12 o MIP应用于动 物组织中药物 及其代谢物、中草药成分提取分离的研究报告较多，也 取得了一批有价值的分析方法和材料13。如郭文生等14采用分 子模板聚合物技术对中草药马钱子St rye h nos nux-vomica L.粗提 物中有效成分马钱子碱（brucine）、士的宁（strychnine）进行了选择性 分离。用丙烯酸为单体，TMPTA为交联剂，合成对马钱子碱有特异选择 性的模板聚合物（MIP） o选择性分离出粗提物中的马钱子碱，纯 度可 达99.7%,同时得到士的

24、宁为主的生物碱，纯度为94.6 %0周力等 15制备了以栩皮素为模板的分子烙印聚合物（ABC）,从沙棘粗提物中 分离提取栩皮素和异鼠李素两种黄酮，得到良好的效果。 &表示MIP的连接位置对烙印分子有较高的装载能力；b表示 由于烙印分子对MIP有较高的亲和力使得烙印药物分子缓慢释放；c表 示烙印对应体（+）被吸附在MIP上，而非烙印对应体（）由于对MIP 连接位置的不相配而释放；d表示在连接位置，由于亲和力的作用，有 较低亲和力的药物被有较高亲和力的药物所取代。 图3类似药物在分子烙印材料上的装载释放过程（略） MIP-HPLC-MS应用于中草药有效成分分离鉴定研究报告 较 少，但以仅有的报告来

25、看，其前景看好。谢建春等16以骆驼蓬种籽 中抗肿瘤活性化合物哈尔明及哈马灵的结构类似物哈尔满作为模板，用 非共价键法制备了对哈尔明及哈马灵具有强亲和性的分子烙印聚合物。 此分子烙印聚合物作为液相色谱固定相与大气压电离飞行时间质谱联 用，直接分离鉴定了草药骆驼蓬种籽甲醇粗提物中所含的哈尔明及哈马 灵两种抗肿瘤活性成分。实验结果证明了通过分子烙印亲和色谱与质谱 联用方法，快速有效地对中草药活性成分分离鉴定是可能的。谢建春等 17尝试以丙烯酰胺作为功能单体，以榊皮素为模板，在极性溶剂 中，用非共价键法制备了 MIP。结果表明，MIP对 栩皮素具有特异亲和 性，将该MIP直接分离银杏叶提取物水溶液，得

26、到主要含模板栩皮素及 其结构类似化合物山奈酚两种黄酮类组分。 利用MIP特异亲和性从中药复方中提取 分离具有相同空间结构、相似 功能团的有效部位，将会成为中药复方有效部位提取 分离的有效手 段。Valla no等18,19 利用分子烙印的原理，以抗抑郁症的去甲替林 (NOR)为模板，将去甲替林烙印粒子填充在毛细管 HPLC 柱 上利用毛细管液相色谱筛选结构类似的抗抑郁症化合物， 结果表明 具有和模板大部分结构类似的化合物都能被印迹分子所识别 ,尤其 是具有环和亚胺的化合物选择性更好。 5MIT的发展趋势 分子烙印高分子技术与分离鉴定的一体化技术，其核心是基 于MIPS的快速高效发展。在未来一段

27、时间MIT的研究可能主要集中在 如下几个方面：分子烙印和识别过程的机理，从热力学和动力学角度 研究增多，从目前的定性和半定量描述向完全定量描述发展， 其应用范 围进一步扩大；合成种类更多性能更好的功能单体和交联剂，提高 MIPS的吸附行为和吸附容量，如最近虽已提出聚酚、聚 氨苯基硼酸酯、 过度氧化的聚毗咯、聚氨酯、聚苯二胺、聚苯胺等，但仅能适应相应特 殊要求，性能尚待完善；分子烙印和识别过程从有机相转向水相，以 便接近或达到天然分子即模拟机体内识别系统的水平，从而提高分子烙 印聚合物的选择性和模拟受体的真实性；在 分离技术方面，手性分离和固相萃取手性药物的MIT步入产业化阶 段，而商品化的可用

28、于检测特定化合物的MIPS将不断出现；烙印技 术将从氨基酸 药物等小分子，过渡到核昔酸 多肽 蛋白质等生 物大分子，甚至生物活体细胞；MIP向高效率高特异性发展，如模板 与功能单体间的多位点协同作用可提高MIP选择性，同时最好结 合多种作用力。如Che ng等20 在制备模拟酶时同时采取3种单体 (MAAv 4-VP和高铁原吓卩林)、3种作用力(氢键 静电和金属配位 作 用)，实现了水相中高的选择性和催化性能。 【参考文献】 ：1杜冠华药物筛选新技术与中药现代化研究J 世界科学 技术-中药现代化，2000, 2 (24) : 47. ：2 王夔中药研究现代方法学M .北京：化学工 业出版社，2

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