【毕业学位论文】（Word原稿）配合饲料中蛋白质原料的溯源技术研究动物营养与饲料科学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 配合饲料 中 蛋白质原料 的 溯源技术研究 on of on of I 摘 要 当前， 饲料 质量安全问题 引发 的 食品安全危机 的频繁爆发 使得 如何 更好地对饲料产品原料来源和组成进行溯源管理 成为广大 饲料管理者、科研工作者、生产者和消费者广泛关注 的焦点 。近红外光谱（ 析技术具有快速，准确，操作简便，无损，成本低，且测量重复性 高的优点，是一种在饲料质量安全等众多领域都有着广泛应用前景的溯源技术 ； 荧光定量 术可以对饲料中不同物种的基因目标片断进 行扩增，从而对饲料组分来源进行判别。本论文分别建立了配合饲料中 豆粕、鱼粉两种成分的 荧光定量 性和定量检测方法，并对两种检测方法进行了比较，为两种方法在饲料质量溯源管理中的推广应用提供 了 理论基础。本研究的主要结论如下： 筛选 了 来源于编码鱼线粒体 12S 242基因片段、来源于编码大豆线粒体 成酶的 137因片段和编码大豆线粒体 18S 142因片段，用作 验中对配合饲料中鱼粉和豆粕成分进行定性检测内源标记物；利用荧光定量 术分别建立了预测配合饲料中 鱼粉、豆粕 含量的标准曲线， 鱼粉 标准曲线 的决定 系数 两种 豆粕 特异引物得到的标准曲线的决定系数分别为 以上标准曲线预测未知样品中的鱼粉和豆粕含量，预测值与真实值的相关性分别为 见， 术用于鱼粉、豆粕的定性和定量检测结果 尚可接受 ，但 仍有 很多不可控因素 限制了该技术的应用。 利用 术建立了鱼粉、豆粕的 标模型，模型的决定系数 别达到 分别为 小于 10%， 大于 3，定标效果良好。通过预测未知样品对所建模型的预测能力进行验证，定性预测的准确度较高。 定量预测时， 未知样品中鱼粉、豆粕的 测值与真实值间决定系数 别达到了 0%， 大于 3，预测精度很好 。结果表明， 术可以很好的对配合饲料中鱼粉、豆粕两种蛋白质原料进行定性和定量 预测 ，实现对配合饲料蛋白质 来源 的跟踪 溯源， 保障 饲料质量。 总之，本实验 对 利用 荧光定量 术 和 术 对配合饲料 中 的鱼粉 和 豆粕进行溯源（定性和定量）进行了 新 的探索 ，取得了较为满意的结果， 这两种技术 可做为对饲料质量 安全 进行有效溯源管理的新 手段 。 关键词 ： 近红外光谱（ 析技术 ， 实时定量 术 ， 溯源 ， 定性 ， 定量 n of on no to is a of to of of of it is an in CR a to in of in in in 43 bp of TP 32 bp of 8S 24 bp of 2S of in CR of R2 of of We of in in of by 2 of of 00% M. be to of In of by A of 录 第 一章 绪论 . 1 究目的和意义 . 1 料质量安全评价 . 1 料质量安全评价的重要性 . 1 料质量安全评价的发展 . 1 踪评价配合饲料原料组成的必要性 . 2 源管理的发展 . 3 源的起源 . 3 源技术 . 3 源技术在食品和饲料安全管理中的应用 . 4 国的饲料产品溯源管理机制亟待完善 . 4 究内容与方法 . 5 究内容 . 5 究目标 . 5 术路线简介 . 5 第二章 术及其在饲料工业中的应用 . 6 红 外光谱技术（ . 6 红外光谱技术的原理 . 6 红外光谱分析过程 . 6 红外光谱分析方法 . 7 . 8 子数的确定 . 9 . 10 . 11 . 11 . 12 定饲料各种化学成份指标 . 12 定饲料消化特性等综合指标 . 13 红外与饲料生产在线监控 . 13 料原料来源分析 . 14 酸分子检测技术（ . 14 聚酶链式反应（ 术 . 14 时荧光定量 . 15 粒体 物种鉴别中的应用 . 16 . 17 第三章 术溯源配合饲料蛋白质原料方法的 研究 . 18 料与方法 . 18 . 18 剂 . 19 要仪器 . 19 . 19 物设计及合成 . 20 . 21 光定量 . 21 果与讨论 . 23 . 23 光定量 . 26 结 . 30 第四章 术溯源配合饲料蛋白质原料方法的研究 . 31 . 31 品制备及处理 . 31 验仪器 . 31 剂 . 33 红外光谱采集 . 33 学分析 . 33 标模型建立及评价 . 33 证及预测结果的判断 . 34 果与讨论 . 34 配料样品配方及待测指标含量分布 . 34 品近红外光谱图 . 37 谱数据处理方法的确定 . 38 谱范围选择 . 41 合饲料中豆粕的定性和定量分析 . 43 合饲料中鱼粉的定性和定量分析 . 46 结 . 49 第五章 种方法的比较 . 51 . 51 . 51 . 51 . 52 结 . 52 第六章 结论及展望 . 53 要结论 . 53 种方法的比较 . 53 新点 . 53 一步研究设想 . 54 参考文献 . 55 致谢 . 62 作者简历 . 63 V 英文缩略表 英文缩 写 英文全称 中文名称 A 相对吸光度 工神经网络 立叶变换中红外光谱 阶平滑 阶 平滑 量命中指数 邻近法 氏距离法 元线性回归 元散射校正 位素比值质谱 红外透射光谱 红外反射光谱 磁共振 光度值 成分 成分分析 成分回归 合酶链式反应 最小二乘法 um 测残差平方和 定系数 制性片段多态性 正标准差 部交互验证均方差 测均方差 对分析误差 对标准差 时荧光定量 互 验证标准差 阶卷积 阶卷积 步多元线性回归 噪比 准正态变换 准正态 变换与去趋势变换 链构象多态性 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究目的和意义 饲料作为人类食物链中的重要一环，其质量与人类健康和食品安全紧密相关；特别是近年来由饲料质量安全问题引 起的 食品安全危机 频发 ， 造成了 人们的恐慌 。而 采用 不同的饲料原料，特别是质量不同的蛋白质原料， 不仅影响饲料产品和畜产品的质量水平， 而且 决定了 饲喂动物时 饲料 的实际营养 价值 ， 因此 如何更好的评价饲料质量和对饲料进行溯源已 经 逐渐 成为 研究者 们 关注的焦点 。但 现有的 很多饲料质量 检测 技术 和溯源方法 成本高，且操作复杂，耗时长，不能快速得到 准确 的 实验结果， 建立 高效简便的饲料原料溯源方法成为 亟待 解决的问题 。 析技术和荧光定量 术 是两种 相对 快速，且具有相当准确度的溯源（定性和定量）技术，已成功用于 农业、石油 化工 等众多领域 ， 本研究探索 了 其 在 饲料 溯源 上 的应用 。 料质量安全 评价 料质量 安全 评价 的重要性 我国饲料工业经过 20多年改革与发展，已经 形成 包括饲料加工业、饲料添加剂工业、饲料原料工业、饲料机械制造工业和饲料科研、教育、标准、检测等 在内的 较 为完备的饲料工业体系。2006年 我 国饲料 工业 产品总产量 达到 已 连续多年稳居 世界第二 ， 饲料工业 在 保障安全优质的畜禽及水产产品供给，促进粮食 增值转化，带动农业经济结构调整，以及 在 农民增收、农业增效和养殖产品竞争力增强等 方面 都 发挥了重要的作用 ， 已 经 成为 促进我国农业 经济发展 和 新农村 建设的重要动力。 饲料质量安全是畜牧业可持续健康发展、动物源性食品安全、生态环境安全、乃至公共安全的基础保障 ，确保和提高饲料产品安全水平是我国饲料工业“十一五”发展规划的重要目标。 由于我国饲料生产、经营的基础设施相对薄弱，饲料 生产、经营者法律意识和卫生意识淡薄，加上我国当前存在着比较严重的环境污染问题，滥用农药现象得不到有效 控制 ，导致饲料原料存在严重的农药残留问题 ， 而 原料掺杂使假等不法行为使 得 饲料 质量 安全问题 更为 严重 。 如何更好的监控饲料质量安全、提高饲料管理法规的 威慑力、增强从业者的自律和责任感已成为提高 饲料质量安全 水平的 瓶颈 问题 ； 因此，创新 和 发展科学的 质量 安全 控制方法和 高效的检测技术 逐渐 引起 广大消费者的高度关注，也对 科研工作者 提出了更高的要求和严峻挑战。 料质量 安全评价 的 发展 人们对 饲料产品，特别是饲料原料 质量水 平 的检测分析和基础数据 的 收集已有 很长 历史， 这中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 些 指标 最初 主要 包括 水分、粗蛋白质、粗脂肪、无氮浸出物、粗纤维和粗灰分等 简单的化学成分 ，和感官指标等 。 随着动物营养学和分析化学等相关基础理论和分析技术的发展，人们 逐渐 将氨基酸组成平衡、净能 、消化率 、抗营养因子、有毒有害成分 等 深入评价饲料 质量 的 指标 纳入 了 饲料质量 安全 评价体系中。 与此同时 ，相应的质量安全 评价技术也 在 不断发展完善，除了常规化学成分分析外，高效液相色谱、原子荧光分光光度计、气相色谱、氨基酸分析仪、气质联用 、 近红外光谱分析仪等大型先进精密的分析仪器 也被用于 饲料 质量的深入评价 中 ， 并 建立 了 相应的 更 准 确快速 的饲料质量 分析 方法。 随着经济的发展，食品安全问题越来越受到社会的关注。饲料作为养殖业的必备 投入品 ，其安全卫生问题直接或间接地影响到动物产品 质量 和人类的安全，是保证食品质量安全关键的一环；食品安全首先是饲料的安全，饲料安全即食品安全的共识已在世界范围内形成。提高饲料质量，保障饲料安全，从而保障动物产品和人民健康已成为世界 各国政府 的重要职责。 特别是 从 上世纪80 年代英国爆发 “疯牛病” 事件 以来， 各国政府 都在 加快建设饲料质量安全监管体系 和创新发展安全评价方法， 并 先后将可追踪管理机制引入到 饲料 质量安全 管理中 ， 而一系列以蛋白质、植物次级代谢物、功能基因和 C 同位素等为物种鉴别参照的溯源技术逐渐出现在 饲料 安全管理领域，并得到越来越多的应用和 快速 发展。 踪评价配合饲料原料组成的 必要性 配合饲料 养分全面且平衡，能够满足饲养动物的各种营养需要， 通过 推广 配合饲料的 使用 以增强 对 质量安全隐患的防控 也 得到越来越广泛的认可 。 配合 饲 料 在 饲料工业 中的 地位举足轻重 。保证 配合饲料的 质量安全是提高畜禽生产性能的基础，直接决定 了 畜禽生长状态和畜产品 质量安全 水平 ， 也 是养殖业健康发展 的基础 和 动物性食品安全 的重要 保障 ，更会影响人类的健康 与安全，因此 在生产和管理中采取有效手段 保证配合饲料质量的稳定十分重要 。 要全面有效的控制 配合 饲料质量安全，不仅要在饲料 生产 加工 、 运输 、 储存 等环节 对饲料质量进行 监控，更重要的是 从源头控制和 确保饲料 原料的 质量 安全。 这是因为： 首先 ，随着 畜牧养殖业发展和 人们 生活水平的提高，饲料原料资源 匮乏问题越来越突出， 使用大量的非常规饲用资源和不断开发新资源成为必然趋势， 而要 实现对这些非常规资源的安全评价需要一个较长的历史时期， 需要全程 监控和 详细 记录这些新资 源的生产使用情况， 因此有必要 对这些原料进行溯源管理 。 其次 ，饲料工业 依靠种植业，服务养殖业 ， 因此 饲料原料的质量评价 不仅 将 给 作物 育种工作提供方向和重要的参考数据，也影响着管理者对种植业结构的引导和调整 。 再次 ， 动物 对由不同原料生产出的营养成分含量相同的配合饲料的最终利用率 可能会 大不相同 ， 这是 因为 不同来源饲料原料 的 物质结构、营养成分等生物化学特性有明显差异， 不同饲料原料中含有不同的抗营养因子，直接影响饲养动物对营养成分的酶解速度和消化吸收率 ， 并且 畜禽在各自的进化过程中形成的体内消化吸收系统、消化酶的组成对饲料原料 也 具有一定的选择性 ，因此 动物对 不同饲料原料的 消化和吸收利用速度和程度不同 。 总之， 饲料原料直接影响动物的生长性能，免疫状态和安全水平， 饲料原料组成是影响 配合 饲料质量水平的一个重要 决定因素和参考指标 ， 有必要 尽快 研究出对 配合饲料原料组成 进行 跟踪评价 的 方法 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 源管理 的发展 源的起源 溯源是 农产品质量安全管理体系中的重要 手段 ， 其 通用定义起源于 1986年 国际标准组织 的 义为通过登记的标识溯源某一 产品 的历史 、 应用或 位置 （ 003） 。 此定义 一方面涵盖 了 产品 的来源，即回溯来源 ；另一方面涉及了产品 的生产模式，即溯源加工过程 。 追溯产品 来源涉及到 产品 的特征 、 种类及地理来源 等指标 ， 通常这些指标参数将直接影响产品的 质量 安全 水平。溯源过程涉及 到 产品 生产体系，包 括 加工和储存过程 ， 及 掺假 等影响产品 质量安全 的任何 行为 。 最 初， 溯源 只 被 用 来 验 证 受 原产地名称 保护的 产品和 区分 功能相近的 市场 商品 。 但 随着 疯牛病 等事件 的 爆发， 以及消费者对消费“ 绿色 ” 动物产品兴趣 的增加和 对 动物福利 的 重 视， 消费者逐渐要求了解动物饲料的详细 信息； 另外， 政府职能部门和 产品认证机构也需要一种控制手段，以 客观地 保证 所制定相关法规的贯彻和遵从， 并 确保认证 产品的 规格说明 和 承诺已 被 完全兑现 。鉴于 以上种种 原因 ， 溯源 管理 开始 被 用于控制 饲料和 食品 的质量 安全。 源技术 溯源技术 有 多种 ，不同方法的适用范围不同 ， 但 其原理 通常 都 是通过分析与产品来源相关的特征信息， 进一步与已建立的 参照标记数据库信息 进行对比，最终确定产品的来源。 目前用于动物饲料 溯源 的方法有四类。一类是利用饲料中植物原料的生物代谢物标记法，即利用饲料中含有的而动物机体自身不能合成的、并将在动物产品或组织中出现的，完全是因为动物食用饲料而出现的化合物作为溯源 标记，例如类胡萝卜素、 二级萜类化合物、酚类和植物烯类等（ 007； ， 2004； ， 1985； ， 1997） 。第二类是利用来源于动物新陈代谢的代谢指标法（间接标记法），如通过分析动物产品中亚油酸，及其衍生物 不饱和脂肪酸的组成含量，判断动物所食用的饲料原料组成（ ， 1997； ； 2000）。 第三类是物理标记法，即 通过检测 放射性同位素含量 分析饲料原料的组成， 利用 物理化学技术进行溯源的技术（ ； 2004a， b），如 离子交换色谱 /原子吸收光谱、核磁共振与 同位素比值质谱 联用（ 核磁共振 场地特定天然同位素分馏法 (。 还有 一类 为综合指标方法，包括利用 光谱学 方法，如中红外和近红外光谱 （ 、 傅立叶变换中红外光谱（ 荧光光谱 等技术，以及 生物学技术 进行饲料原料组成的分析 ， 如 传统生化技术（抗生素分析 、 酶联免疫测试等） 和 分子生物学技术（变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性） 等 。 溯源技术的 选择很大程度上取决于前期的基础研究（对研究对象 特征信息 的了解程度） 。 对 产品 来 源的描述可能是来自多种分析技术 的共同结果 ， 应用相关溯源分析技术后就会产生相应 的初步 溯源结果，而后这 些 结果再经过数学或统计学方法分析和处理，得到最终的溯源结果。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 源 技术 在 食品 和 饲料安全 管理中的应用 近年来各种食品 和饲料安全事故 频 发 ，尤其是疯牛病、 禽流感 、苏丹红等 食品安全危机使广大消费者对食品安全和饲料安全问题心有余悸。为了树立消费者对食品质量安全的信心，一些发达国家纷纷实施食品 和饲料 质量安全追溯制 度 ，不断加强对食品的生产、储存、运输和销售各个环节的控制，在生产环节建立验证和注册体系，强制性实行食 品生产和销售情况透明度政策，强化可追溯制度的实施。 欧盟法规 002要求从 2004年起在欧盟范围内销 售 的所有食品都能够进行跟踪与追溯，否则就不允许上市销 售 。 同时，从 2005年欧盟开始实施水产品贸易追溯制度。 另外，针对转基因生物的问题， 欧盟 也出台了很多与溯源管理相关的法律法规，如 转基因生物环境释放法（ 2001） 、（ 1829/2003、 （ 1830/2003、 （ 65/2004、 （ 641/2004等， 这些法规对 进入环境的转基因生物，新的转基因食品和饲料产品 的 审核 批准 ， 对 存在于和 由于偶然或技术上无法避免的原因而存在于产品中的转基因原料的标注，及对 转基因生物 和 由转基因生物制成的食品和饲料产品 进行 溯源和标注 等问题作出了详细规定 。 美国对美国本土 的和 对美出口的食品和饲料等要求在进行追踪与溯源；另外还建立 了 家畜追溯系统，提高从农场到加工厂的追踪鉴别能力，以防范疯牛病、口蹄疫等问题。日本也 建立 了相应的追溯体系，对与消费者有关的所有农产品、食品和饲料的溯源等都作出了规定。 国 的 饲料产品溯源管理机制 亟待 完善 随着社会经济的迅速发展、人民生活水平的不断提高，消费者 对畜产品的需求已渐渐由“量变”转为“质变”，整个社会和广大人民群众对畜产品的质量安全问题提出了更高的要求 ，而饲料产品质量安全是影响畜产品质量安全的直接因素 ； 因此， 要求 我们不断完善饲料工业的溯源管理体系 。 在饲料工业中应用溯源技术，有利于饲料安全问题的防控与解决；有利于明确饲料生产 /经营者的责任；能够为贯彻实施饲料监管法规提供技术支持；通过溯源技术分析辨别配合饲料原料组成，可以更科学的评价饲料品质；而且对饲料工业实行严格的溯源管理也是整个食品链溯源管理中的重要一环。 对饲料产品质量安全进行跟踪与追溯不仅是我国饲料 工业“十一五”发展规划确定的重要任务，也是当今世界发展的一个方向， 是 大势所趋。 我国 饲料生产、质量检测体系和饲料相关基础学科 发展的 基础薄弱， 饲料生产企业生产规模和技术水平参差不齐，各种与饲料产品质量安全相关的基础信息库严重缺乏，溯源技术和检测标准体系发展明显滞后于饲料工业的发展， 并且 相关的法律体系 也 尚需进一步完善，这些问题制约着我国饲料工业溯源管理体系的建设和正常运转 。 因此，研究建立 更为高效准确的 溯源技术 和 方法不仅具有 广阔的 应用前景，而且具有明显的社会意义。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 究内容与方法 究内容 研 究内容主要包括： （ 1） 探讨近红外光谱分析技术定性和定量检测配合饲料原料组成的可行性； （ 2） 利用近红外光谱分析技术溯源配合饲料中主要的蛋白质原料鱼粉和豆粕 ，确定饲料的蛋白质来源 ；建立 相应的 定性判别分析和定量预测模型 ，并对模型进行验证 ； （ 3） 筛选和确定可 作为对 配合饲料 中的 蛋白质 原料 （主要是 鱼粉和 豆粕） 进行定性和定量检测 的 内源标记物的基因片段； （ 4） 研究 对 配合饲料中主要的蛋白质原料鱼粉和豆粕 进行 检测 的 荧光定量 法； （ 5） 比较分析所建立的 近红外光谱分析技术 检测方法和荧光定量 测方法的准确性和重复性。 究目标 探索 利用近红外光谱技术和荧光定量 术 ， 建立有效 检测 配合饲料所用主要蛋白质原料 鱼粉和豆粕 的检测方法， 溯源配合饲料的蛋白质来源，推动 溯源管理 配合饲料原料组成的支撑技术 的 发展， 为更好的实施饲料质量管理 、 保证饲料质量安全提供一种更便捷有效的手段 。 术路线简介 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 术及其在饲料工业中的应用 6 第二章 术及 其 在饲料 工业 中的应用 红外光谱技术 （ 红外光谱技术的原理 近红外光是指波长介于可见区与中红外区之间的电磁波，其波长范围为 8002500数范围为 125004000。近红外光谱 （ 技术 是指利用近红外谱区包含的物质信息，主要用于有机物质定性和定量分析的一项分析技术（陆婉珍， 2000） 。 近红外谱区主要是有机物含氢基团（如 ）的伸缩振动的各级倍频和这些集团的伸缩振动与弯曲振动的合频吸收，几乎包含了有机物中所有含氢基团信息，蕴含着分子的结构、组成状态等信息（吴瑾光， 1994） ， 从而为近红外光谱分析样本的物理性质（如粘度、粒度、硬度等）以及化学成分（如蛋白质、氨基酸、脂肪、淀粉、水分等）提供了可能。 利用近红外光 谱分析技术可采集到构成样品的所有有机化合物的组成和结构信息。通过综合整理加工这些信息，一方面可获得具有强特异性、且能够准确反映被测样品个性特征 的 信息；另一方面能够获得样品近红外光谱与有机化合物组成和结构间存在的一定对应函数关系，从而对样品的物理化学特性做出预测。 基于近红外光谱分析技术 的 特点， 它 不仅可以用于分析单一化合物的成分含量；而且利用其能够准确采集被测产品个性特征信息的优势，同时结合图像处理技术，还可将 其 用于被测样品的溯源管理、赝品鉴别等。特别是近年来，电子技术、计算机技术、数学统计学理论、化学分析理论的发展，进一步促进了近红外光谱分析技术在农产品质