【毕业学位论文】(Word原稿)茄子内生细菌群落结构及对其青枯病发病特性的影响-分子植物病理学与植病生理学

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： (S/B) 福建农林大学硕士学位论文 茄子内生细菌群落结构及对其青枯病 发病特性的影响 学 科 门 类： 农学 一级学科名称： 植物病理学 二级学科名称： 分子植物病理学 研 究 方 向： 分子植物病理学与植病生理学 研 究 生： 指 导 教 师： 教授 研究员 完 成 时 间：二 年四月 2005 级植物病理学硕士学位论文 - 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农 林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 2005 级植物病理学硕士学位论文 - 目 录 第一章 综述 . 1 1 茄子青枯病的研究进展 . 1 枯病的发生与危害 . 1 枯菌的致病机理 . 1 枯病的生物防治 . 1 2 内生细菌与植物病害 . 2 生细菌概述 . 2 生细菌与宿主植物间的关系 . 3 生细菌与植物病原菌的关系 . 3 生细菌的应用前景 . 4 3 研究新意 . 4 第二章 茄子植株内生细菌群落结构多态性 . 5 前言 . 5 1 材料与方法 . 5 验材料 . 5 生细菌及青枯雷尔氏的分离 . 6 生细菌 的鉴定 . 6 2 结果与分析 . 8 子内生细菌鉴定 . 8 同部位茄子植物内生细菌群落结构 . 10 同地区茄子植物内生细菌群落结构 . 11 同植株状态茄子内生细菌群落结构 . 11 3 小结与讨论 . 12 结 . 12 论 . 13 第三章 优势内生细菌与青枯雷尔氏菌的相互关系 . 14 前言 . 14 1 材料与方法 . 14 试材料 . 14 合培养基的优化选择 . 15 培养条件下优势内生细菌与青枯雷尔氏菌强致病力菌株生长动态分析 . 15 2 结果与分析 . 15 合培养培养基的优化选择 . 15 2005 级植物病理学硕士学位论文 - 培养条件下优势内生菌与青枯雷尔氏菌强致病力菌株生长动态分析 . 17 势内生细菌与青枯雷尔氏菌生长相互关系 . 18 3 小结与讨论 . 18 结 . 18 论 . 19 第四章 优势内生细菌对青枯 雷尔氏菌生物学特性的影响 . 20 前言 . 20 1 材料与方法 . 20 试材料 . 20 株的挑选 . 21 列鉴定 . 21 外吸收测定 . 22 肪酸含量测定 . 22 态性 . 23 致病特性的影响 . 23 2 结果与分析 . 24 株的挑选 . 24 列鉴定分析 . 24 外吸收变化 . 26 肪酸特性变化 . 27 理后青枯雷尔氏菌 态性变化 . 27 病特性 . 29 3 小结与讨论 . 30 结 . 30 论 . 31 第五章 总结与展望 . 32 1 总结 . 32 2 展望 . 32 参考文献 . 33 附录 . 37 个人简历 . 44 致谢 . 45 2005 级植物病理学硕士学位论文 - V - 中文摘要 摘要 ： 对 福州福清 、莆田东洋镇、泉州晋江采集的田间健康及发生青枯病的茄子植株进行内生细菌的分离，从中分离到以 为主要类群的 19 类内生细菌。 茄子内生细菌的种群及数量随植株不同部位、不同地区及不同发病程度有所变化。采集于福州福清的健康茄子植株 根部的内生细菌种类多 ，可达 9 种 ，叶部最少 ，仅有 4种 ； 在内生细菌 数量 方面，茎部最多，可达 05g，叶部只有 04g。 健康植株的内生细菌种类明显多于发生青枯病的植株。不同地区的内生细菌种类也明显不同。 通过因素轮换法和正交试验设计， 确定内生细菌与青枯雷尔氏菌共培养的培养基配方为：葡萄糖 5g，酵母膏 5g，蛋白胨 10g。 将分离到的内生优势细菌 943、 946、 964与青枯雷尔氏菌 1305 进行共培养 时 ，发现 943 与 1305 共培养时，青枯雷尔氏菌 1305几乎不生长， 943 对 1305 有一定的拮抗作用；而 946、 964 与 1305 共培养时，两者生长菌量均较单独培养时减少，因此 946、 964 可以与 1305 共生，但由于 生长 条件的限制，表现为竞争关系。 通过对菌株 列的测定，表明所挑选的菌株均为青枯雷尔氏菌，与青枯雷尔氏菌标准菌株 列的同源性达 99%以上。 经优势内生细菌处理后的青枯雷尔氏菌生理及致病性测定后，当 =，紫外吸收、当 =脂肪酸类型 都可分成三大类 ， 当 = 态性经聚类分析 菌株可分成四类 。 但从本质上，可以分成两大类，一类为强致病力菌株，另一类为弱致病力菌株。 经组培苗和盆栽苗的致病性测定，组培苗不论致病力强弱均发病，盆栽苗仅强致病力的菌株发病死亡。 关键词 ：青枯雷尔氏菌，内生细菌，致病特性 2005 级植物病理学硕士学位论文 - 英文摘要 We 9 of s of of s In of 05g, 04g. of of s By of g, g, 0g. on 43、 946、 964 . 305, 43 305, 46、 964 305 of of . . TS of 9%. of . of = UV of be = of be in be is is in of of in or of of 005 级植物病理学硕士学位论文 - 1 - 第一章 综述 茄子（ .）原产于东南亚、印度，在世界各地均有栽培，在我国也是主要的蔬菜之一，但茄子的产量和质量受多种病虫害的影响，其中茄子细菌性青枯病已成为影响茄子生产的主要障碍之一。 1 茄子青枯病的研究进展 枯病的发生与危害 植物青枯病（ 由青枯雷尔氏菌（ 起的一种土传性的毁灭性病害，是许多植物的重大病害之一，广泛分布于热带、亚热带及温带地区。植物青枯病菌寄主广泛，可侵染 50 多个科的数百种植物（ et ,2006），其中以茄科作物受害最为严重。 枯菌的致病机理 青枯菌的致病机制非常复杂，存在着如胞外多糖（ 胞外蛋白（聚甲基半乳糖醛酸脂酶（ 纤维素酶（ 果胶酶等（何礼远等， 1995）、细菌的运动性（ et ,2006）等多个与致病性相关的因素。 目前比较 一致结论是，胞外多糖在青枯菌致病过程中是重要因素，但不是唯一的，主要在引起萎蔫症状上起关键作用。康耀卫等（ 1995）通过转座子诱变技术，采用定点标记突变等手段，获得了许多类型的青枯雷尔氏菌突变体，同时，也克隆了有关胞外大分子蛋白的基因，从分子水平上开展了胞外大分子在青枯雷尔氏菌致病中的作用研究，研究结果表明：植物青枯病的胞外酶可降解植物细胞壁，对青枯雷尔氏菌的侵入和扩展起着主要作用，当青枯雷尔氏菌的胞外多糖结构基因发生突变后，所产生的胞外多糖缺失突变体失去了对寄主植物的致萎力，引起植物致萎的主要原因 是影响了其水分的输导；然而，青枯雷尔氏菌产生的胞外多糖在结构上非常特殊，它在致病中的作用是否为简单作用，还有待于进一步研究。 枯病 的生物防治 青枯病是一种土传性病害，防治极其困难。化学药剂防治容易造成环境污染，农药残留以及病原菌抗药性的增强等种种问题，而传统的抗病育种的方法也因育种年限长，抗性品种抗性丧失等问题的限制，不能长效地利用。目前，最有效的方法就是生物防治。青枯病的生物防治主要有利用无致病力青枯雷尔氏菌、芽孢杆菌以及青枯菌的拮抗菌和内生拮抗菌。 致病力青枯雷尔氏菌的利用 任 欣正等（ 1993）用 株 治番茄青枯病，均取得温室2005 级植物病理学硕士学位论文 - 2 - 或小区试验的良好的防效，但后期防效降低，大田试验未取得成功，这可能主要由于株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏与其它微生物的竞争力所致。郑继法等（ 1994）研究了烟草细菌性青枯雷尔氏菌的无无毒产细菌素菌株对烟草青枯雷尔菌 4果指出：用浸根法处理 个无毒菌株对致病菌 4庆河等（ 2004）利用紫外诱变法获得的青枯无致病力菌株 理番茄， 发现对青枯病产生抗性，且两种突变体都可在番茄体内定殖和繁殖。王羽等（ 2004）从有青枯病的番茄茎中分离出 198 株无致病力青枯菌，室内平板拮抗试验有 39 株菌株可明显抑制青枯菌的生长，温室盆栽试验筛选出 2 株有较好控病效果，防效分别为 43%和 47%。 孢杆菌的利用 利用芽孢杆菌防治青枯病受到了重视，用于防治青枯病试验的芽孢杆菌有：多粘类芽孢杆菌（ et ,1985）、枯草芽孢杆菌（ et ,1993）、凝固芽孢杆菌（ （ M, et ,1998） 、蜡状芽孢杆菌（ et ,1995）、巨大芽孢杆菌（ 杨合同等， 2002）等等，试验防效在 45% 95%。徐进（ 2002）等利用 2 株从土壤中筛选到的芽孢杆菌对青 枯病进行室内试验及田间试验，在温室盆栽试验中对番茄青枯病的防效达 在田间试验中对马铃薯青枯病的防效可达 朱育菁等（ 2004）利用生防菌 剂对连作重病区的茄子青枯病具有良好的防效 ，可棕 枯菌的拮抗菌及内生拮抗菌的利用 郭坚华等（ 2001）用抑菌圈 株对青枯菌有拮抗作用而又极易人工培养的菌株，在田间的防效在 间，平均增产效果在 间。黎起秦等（ 2005）用内生细菌 室内对番茄青枯病进行防效测定，结果表明用淋根法先接 后接种病原菌和用注射法先接种 后接种病原菌的处理可取得 而用淋根法 、注射法同时接种 与病原菌的处理防效较低。 2 内生细菌与植物病害 生细菌概述 植物内生菌（ 指那些其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物不表现出（或暂不表现）外在病状（ , et 1995），可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物 方法在证明其内生性（ , et 1997）。 内生细菌普遍存 在于各种陆生和水生植物中，研究发现内生细菌具有丰富的生物多2005 级植物病理学硕士学位论文 - 3 - 样性。对一种植物而言，分离到的内生细菌可达数种至数十种，现代分子系统学研究也表明，同一种内生细菌往往还具有多样化的遗传性（邹文欣， 2001）。目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过 129 种（隶属于 54 个属），这些内生细菌大多为土壤微生物种类，其中假单胞菌属（ 芽孢杆菌属（ 肠杆菌属（ 及土壤杆菌属（ 最常见的属（ K, et 2002； , et ,2003）。 内生细菌的生物多样性受多种因素的影响。大量的研究表明，不但不同植物种类之间内生细菌的类群存在一定的差异，而且同一植物的不同器官、不同生育期、不同生长地区和环境以及不同品种之间也存在明显差异。气候条件也影响内生细菌的类群；内生细菌的类群多样性甚至也受树冠的高度和郁闭度的影响，如在高、密度大、封闭均质的树冠上内生细菌种类数量和丰度要比在矮、开放、暴露混合的树冠上的高（ , et ,1998）。 植物内生细菌的种群数量 与植物的种类、基因型、器官、生长阶段、植物自身的营养条件及外在环境条件等密切相关。不同的植物种类内生细菌的种群组成不同，且种群数量变化也较大。 生细菌与宿主植物间的关系 内生细菌与宿主植物间存在着复杂的互作关系。互作关系有：拮抗作用（ 中性关系（ 偏利共生关系（ 互惠共生关系（ 。 内生细菌长期生活在宿主体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中形成了共生的关系。一方面内生细菌可以从宿主中吸收营养供自 己生长的需要，另一方面内生细菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。感染内生细菌的宿主往往具有生长速度快（何红等， 2002） 、增加产量（徐进等， 2004），抗逆境（ E, et ,1998）、抗病害（傅正擎等， 1999）等优势，比未感染植株更具有生存竞争能力。 生细菌与植物病原菌的关系 微生物间的关系主要有互生、共生、拮抗、竞争。互生是两种可以单独生活的微生物共存于同一环境中，通过各自的代谢活动而有利于对方，或偏利于一方的一种生活方式。共生是两种微生物共居在一起，相互分 工协作，相依为命，甚至形成在生理上表现出一定的分工，在组织和形态上产生了新的结构的特殊的共生体。共生一般有二种情况：互惠共生即二者均得利和偏利共生即一方得利，但另一方并不受害。拮抗是二种可以单独生活的生物，当它们生活在一起时，一方产生的代谢产物可抑制另一方的生长甚至将后者杀死。竞争是不同的微生物在同一环境中，对营养等资源进行竞争，互相受到不利影响。在植物体外，内生细菌与植物病原菌也具有这种关系，较为普通的是互生、拮抗与竞争关系。但在植物体内，内生细菌与植物病原菌的关系又如何呢？在病原菌侵入植2005 级植物病理学硕士学位论文 - 4 - 物体内时，某些内 生细菌菌株在数量上急剧增加，使植物体内的优势菌种群不被病原菌所代替，以保证植物体原有的微生态平衡（ , et ,1998）。 生细菌的应用前景 由于内生细菌存在于植物体内，所处环境稳定并可在植物体内长期定殖并传导，对植物的生长发育、抵御病虫害及不良环境的影响等具有广泛的作用，是不可多得的天然生物资源，具有广泛的应用前景及开发潜力。 生生防菌剂 使用化学农药是控制作用病虫害的有效方法，但化学药剂污染环境，易产生抗药性，破坏生态平衡，还有残留问题，因此植物病害 的生物防治越来越重要。植物内生细菌可以通过分泌抗生物质（ V, et ,1999； , et ,1998）和诱导植物系统抗性（ G, et ,1996）等不同机制，起到减轻和防治植物病害的生物学作用。 目前，利用内生细菌来防治病虫草害在国内外也有报道。杨海莲等（ 2001）利用从水稻中分离的内生阴沟肠杆菌（ 菌液喷洒水稻叶片，结果表明能够明显提高对水稻对白叶枯病、稻瘟病、纹枯病的抗性。石晶盈等（ 2007）采用喷雾法接种 在番木瓜叶片、叶柄、果皮和果肉中定殖，进行采后防病试验，对采后番木瓜疫病和炭疽病的防效分别达 能内生细菌资源的构建 内生细菌是构建 工程菌 的理想载体。因内生细菌具有在植物体内定殖、繁殖、转移的特点，将某些抗病虫基因导入到内生细菌中，能提高植物的抗病虫能力，而植物本身的基因并未发生改变，这样可以保持植物的天然性状（石晶盈等， 2006）。段灿星等（ 2002）利用 3 株转 Bt lA(c)基因的抗虫工程菌对亚洲玉米螟进行离体生物测定，发现 注射接种抗虫工程菌的处理株对玉米螟有明显的抗性。 3 研究新意 青枯雷尔氏菌具有潜伏侵染的特性 （ , et ,1992; 廖伯寿等， 1998） ，为什么会产生这种现象呢？是不是因为植物体内的内生细菌对青枯雷尔氏菌的侵染有所影响？如果是，那么内生细菌是如何影响影响青枯雷尔氏菌的呢？ 本试验通过从茄子中分离到优势内生细菌在实验室条件下对青枯雷尔氏菌进行处理，与青枯雷尔氏菌共培养，观察青枯雷尔氏菌的生长与青枯雷尔氏菌菌株致病力的变化。共培养后进一步对处理后青枯雷尔氏菌进行生理特性和致病力 特性的研究，观察处理后的青枯雷尔氏菌是否在生理特性和致病特性上发生变化，从而推断内生细菌对青枯雷尔氏菌致病特性的影响力，进一步推断植株内生细菌群落的结构对青枯雷尔氏菌的致病特性是否有影响。 2005 级植物病理学硕士学位论文 - 5 - 第二章 茄子植株内生细菌群落结构多态性 前言 植物内生细菌是植物体内的微生物中比较庞大的一个群体，广泛存在于种子、根、茎、叶、果实等器官中。植物内生细菌具有宿主特异性，而且在同一宿主的不同器官、生育期及宿主所处环境的不同，其类群结构各有不同（ et 2003）。已有研究表明，植物内生细菌具有 提高植物抗病性的功能，了解内生细菌的群落结构多样性对有效地利用内生细菌防治植物病害具有重要意义。 通过分离茄子从不同地区采集的健康及发生青枯病的植株中的内生细菌，明确茄子植株内生细菌菌群的组成、菌群密度的分布特点及种植地区、不同部位、植株的健康状态对内生细菌分布的影响，从而了解植物内生细菌与植物病原菌间的消长关系，为内生细菌资源的进一步研究和开发利用奠定基础。 1 材料与方法 验材料 本采集：从福州福清、泉州晋江、莆田东洋镇等地采集结果期的茄子健康植株及发生青枯病植株样本分析内生细菌 的种类及数量。 养基 与试剂 普通细菌分离用 养基，青枯雷尔氏菌分离用 养基，细菌的保存用 养基：牛肉浸膏 3g，酵母浸膏 1g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，琼脂 18g，蒸馏水 1000养基：蛋白胨 10g，酪朊水解物 1g，葡萄糖 5g，琼脂 18g，蒸馏水 1000mL，度调节到约 装，灭菌（ 121 ） 20过滤灭菌的 1%的 2， 3， 5氯化三苯基四氮唑（ 水溶液到冷却到 55 左右的灭菌培养基中，使最终浓度达到 养基：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g， 0g，蒸馏水 1000mL，肪酸提取处理试剂： 试剂 1 45 g 甲醇（ 150 离子蒸馏水 150 005 级植物病理学硕士学位论文 - 6 - 水和甲醇混合后加入 ，同时搅拌至完全 溶解 试剂 2 酸 25醇（ 275 把盐酸加入到甲醇中，并不断搅拌 试剂 3 正己烷 ( 200 200 入到正己烷中，并搅拌均匀 试剂 4 离子蒸馏水 900 生细菌及青枯雷尔氏的分离 采用表面消毒研磨法及平板稀释分离法。将茄子植株样本分成根、茎基、茎中、茎顶、叶五个部分，置于 75%乙醇中浸泡 1，于 汞中消毒 2 3即用无菌水漂洗 3 次（除去剩余升汞）。将样品移入无菌研钵中，用灭菌剪刀剪碎后加入 10分研磨。静止 20 30，吸取 1行梯度稀释，取后三个稀释度涂板，每个浓度 3 个重复。完成后，平板置于 3