（材料学专业论文）氮掺杂有序介孔碳的制备及高性能漆酶生物传感器的研究.pdf

摘要 介孔碳材料独特的结构及性能，使其研究与应用取得了很大进展，但是其孔 径较小且载酶量少、酶易脱落等，使得介孔碳应用于酶生物传感器的研究亟待发 展。漆酶( l a c ) 生物传感器具有灵敏、快速、简便和准确等优点，是检测酚类 等污染物质重要的方法。论文从提高介孔碳的电化学活性和酶传感器的稳定性着 手，对介孔碳进行改性，合成了掺杂氮原子的介孔碳n o m c ，以及以环氧树脂 为碳源的介孔碳与聚苯胺的复合材料e o m c p a n ，通过低温n 2 吸附脱附、透射、 红外、紫外、x r d 、电化学测试等对其进行研究；并将其分别用于固定化漆酶， 构建综合性能良好的直接电化学传感器，拓展其在环境微分析等领域中的应用。 本文以s b a 1 5 为模板，廉价易得的苯胺为碳源，制备了具有均一的二维有 序六角介孔结构的掺杂氮原子的有序介孔碳( n o m c ) 。低温n 2 吸附脱附测试 说明该材料具有较大的比表面积、孔容以及孔径分布范围较窄。研究结果表明， 由于氮原子的引入，同时聚苯胺可以为介孔碳壁中形成的片状石墨提供大量的苯 环，在低温下即可形成高度石墨化的介孔碳，进而提高了材料的电活性。电化学 表征证明掺杂氮原子的介孔碳的电催化活性相比纯介孔碳明显增大。 本文首次以n o m c 作为固定化漆酶的载体，并借助生物相容性和成膜性好 的聚乙烯醇( p v a ) 构建了漆酶生物传感器。n o m c 修饰l a c 电极催化邻苯二 酚是一电子一质子的表面控制准可逆过程。在最优的实验条件下，与以葡萄糖为 碳源的g o m c 相比，n o m c 构建的漆酶传感器表现出更好的综合性能，其对底 物邻苯二酚的选择灵敏度( o 0 9 6 5 91 t m ，1 1 = 2 6 ) 、表观米氏常数k s ( 6 4 2 9 3g m ) 、 检测限( 0 1 5 9 a m ，s n = 3 ) 相比已经报道的结果都得到了明显的改善：n o m c 中较高电负性的氮原子可以与带负电荷的漆酶更好的结合，使得漆酶传感器的重 复性和稳定性得到明显的提高。 采用海因环氧树脂为碳源制备了e o m c ，将其与苯胺通过电化学聚合得到 复合材料e o m c p a n ，e o m c 上的7 c 电子与聚苯胺中的7 【电子通过7 【7 【非共价 键作用相结合。然后将第二代和第三代酶传感器的优势有效的结合，即在e o m c 固定漆酶的基础上，在介孔碳的外围包覆一层易于底物扩散的聚苯胺膜，增加了 传感器的稳定性。电化学测试表明，与未改性的e o m c 相比，经聚苯胺改性的 e o m c 和其固定化漆酶后修饰的电极均显示了更好的直接电化学活性。而且由 于聚苯胺的加入，构建的漆酶传感器的低检测限和线性范围也得到明显的改善。 关键词：邻苯二酚介孔碳改性石墨化苯胺漆酶牛物传感器 a b s t r a c t o r d e r e dm e s o p o r o u sc a r b o n ( o m c ) h a ss p e c i a ls t r u c t u r ea n dp e r f o r m a n c e b a s e do nt h i s ，g r e a tp r o g r e s sh a sb e e nm a d ei ni t sr e s e a r c h e sa n da p p l i c a t i o n s h o w e v e r , t h es t u d i e so nt h ea p p l i c a t i o no fo m c i n t ot h ee n z y m eb i o s e n s o r sn e e dt o d e v e l o pu r g e n t l y , o w i n gt oo m c ss m a l lp o r es i z e ，l i t t l ee n z y m e s l o a d i n g ，e n z y m e s e a s yt oe s c a p e ，e t a 1 l a c c a s eb i o s e n s o ri sw i d e l yu s e df o rt h ed e t e c t i o no f c o n t a m i n a n t sl i k e p h e n o l i cc o m p o u n d s ，b e n e f i t i n g f r o mi t s a d v a n t a g e o u s c h a r a c t e r i s t i c s ：s e n s i t i v i t y , r a p i dr e s p o n s e ，c o n v e n i e n c ea n da c c u r a c y t h e r e f o r e ，t h e p r e s e n ts t u d yw a sa na t t e m p tt om o d i f yo m cf o ri m p r o v i n gi t s e l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t ya n de n z y m eb i o s e n s o r ss t a b i l i t y , a n dt os y n t h e s i z en o m cd o p i n gn i t r o g e n a t o m sa n de o m c p a n ，w i t hm e t h o d so fn i t r o g e na d s o r p t i o n - d e s o r p t i o n ，t e m ，f t i r u vx r d ，e l e c t r o c h e m i c a lt e s t ，e t c t h e r e a f t e r , n o m ca n de o m c p a nw e r e r e s p e c t i v e l ya p p l i e dt oi m m o b i l i z a t i o no fl a c c a s ea n db u i l dd i r e c te l e c t r o c h e m i c a l l a c c a s eb i o s e n s o r so fg o o dc o m b i n a t i o np r o p e r t y , w h i c hc o u l de x t e n dt h e i rn e w a p p l i c a t i o n si nt h ee n v i r o n m e n t a lm i c r o a n a l y s i s t h eo r d e r e dm e s o p o r o u sc a r b o nd o p i n gn i t r o g e na t o m s 州- o m c ) w a sp r e p a r e d w i t ht h eu s eo fs b a l5a st e m p l a t er e a g e n ta n dc h e a pa n i l i n ea sc a r b o nr e s o u r c ei n t h et h e s i s t h en - o m ct h u sp r e p a r e dh a dt h eh o m o g e n e o u st w o d i m e n s i o n a l m e s o s t r u c t u r eo fo r d e r e dh e x a g o n ，w i t hal a r g e rs u r f a c ea r e a , p o r ev o l u m ea n dav e r y n a r r o wr a n g eo fp o r es i z ed i s t r i b u t i o n ，w h i c hw e r ec o n f i r m e dt h r o u g hn i t r o g e n a d s o r p t i o n - d e s o r p t i o n t e s t t h er e s e a r c hr e s u l t s p r o v e d t h a th i g h d e g r e e s o f g r a p h i t i z a t i o no fo m cc o u l db ef o r m e da t l o wt e m p e r a t u r e s ，a sar e s u l to ft h e s u c c e s s f u li n t r o d u c t i o no fn i t r o g e na t o m si n t ot h eo m ca n dal a r g en u m b e ro f b e n z e n er i n g sp r o v i d e db yp o l y a n i l i n ef o rt h ef o r m a t i o no fg r a p h i t es h e e t si nt h e o m c ，c o n s e q u e n tu p o nw h i c hh i g h e re l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t yo fo m c w a so b m i n e d t h er e s u l t so fe l e c t r o c h m i c a lt e s t sf u r t h e rs h o w e dt h ee l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yo fo m c d o p i n gn i t r o g e na t o m sw a sb e t t e rt h a nt h a tw i t h o u tn i t r o g e na t o m s t h ep r e s e n ts t u d yw a st h ef i r s ta t t e m p tt ob u i l dal a c c a s eb i o s e n s o r , m a k i n gu s e o ft h en o m ca st h ei m m o b i l i z e dl a c c a s em a t e r i a l a n dw i t ht h ea i do fp o l y v i n y l a l c o h o l ( p v a ) h a v i n gg o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n df i l m f o r m i n g n o m cm o d i f i e dl a c e l e c t r o d ec o u l d c a t a l y z e c a t e c h o l ， a n di t sp r o c e s sw a sr e v e r s i b l ew i t h o n e p r o t o n o n e e l e c t r o ns u r f a c ec o n t r o l l i n g i nt h eo p t i m a le x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ， c o m p a r e d t og o m cw i t hg l u c o s ea sc a r b o nr e s o u r c e ，t h es e n s o rb u i l tb y n - o m c + l a c p v as h o w e db e t t e ri n t e g r a t e dp e r f o r m a n c e s ，t h a ti st os a y , t h e s e n s i t i v i t y ( 0 0 9 6 5 9p m ，n = 2 6 ) ，m i c h a e l i sc o n s t a n t ( 6 4 2 9 3p m ) a n dd e t e c t i o n l i m i t a t i o n ( 0 15 9l a m ，s n = 3 ) w e r ea l le n h a n c e di nc o n t r a s tw i t ht h er e s u l t sr e p o r t e d ； h i g h e re l e c t r o n e g a t i v en i t r o g e n a t o m si nt h es y n t h e s i z e dn - o m cc o u l db e t t e r c o m b i n ew i t hl a c c a s ec a r r y i n gn e g a t i v ec h a r g e s ，w h i c hi m p r o v e dt h eb i o s e n s o r s r e p r o d u c t i o nq u a l i t ya n ds t a b i l i t y t h ep r e s e n ts t u d ys y n t h e s i z e dt h eo r d e r e dm e s o p o r o u sc a r b o n e o m cw i t h h y d a n t i o ne p o x yr e s i na s c a r b o nr e s o u r c e ；t h e n ，e o m cw a sc o m b i n e dw i t ht h e a n i l i n et oo b t a i ne o m c p a nb ye l e c t r o c h e m i c a lp o l y m e r i z a t i o n 冗e l e c t r o n i c sb o t hi n e o m ca n dp o l y a n i l i n ew e r ec o m b i n e db yn o n c o v a l e n tb o n do fn 一尢t h e nt h es t u d y c o m b i n e dt h ea d v a n t a g e so fs e c o n da n dt h i r dg e n e r a t i o ne n z y m es e n s o re f f e c t i v e l y , t h a ti s ，a f t e rl a c c a s ew a sf i x e di ne o m c ，p o l y a n i l i n ef i l mw a sc o a t e do nt h es u r f a c e o ft h eo m c t h i sf i l md i f f u s e ds u b s t r a t ee a s i l ya n di n c r e a s e dt h es t a b i l i t yo ft h e s e n s o r t h ee l e c t r o c h m i c a i t e s t ss h o w e d t h a t ，c o m p a r e d w i t ht h ee o m c ， e o m c p a n a ue l e c t r o d ea n dt h ee o m c p a n + l a c a ue l e c t r o d ea l lp e r f o r m e db e t t e r d i r e c te l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t y m o r e o v e r ，d u et oi n t r o d u c t i o no ft h ep o l y a n i l i n e ，t h e d e t e c t i o nl i m i ta n dt h el i n e a rr e s p o n s er a n g eo ft h el a c c a s es e n s o rb u i l tw e r eb o t h i m p r o v e d k e yw e r d s ：c a t e c h o l ，m e s o p o r o u sc a r b o n ，m o d i f i c a t i o n ，g r a p h i t i z a t i o n ， a n i l i n e ，l a c c a s eb i o s e n s o r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：走鸳鸯 签字r 其l j ： 冽年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤盗盘鲎 有关保留、使用学位论文的规定。 特授权叁盗叁堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 赵盘真 签字同期：w 胡年月j r 导9 7 签名：榷争 签字同期：细巧绰多月 f 日 第一章绪论 1 1 生物传感器 1 1 1 生物传感器的原理 第一章绪论 从2 0 世纪6 0 年代c l a r k 和l y o n 提出生物传感器( b i o s e n s o r ) 的设想开始， 生物传感器的发展距今已有4 0 多年的历史【l 】。生物传感器是生物学、医学、电 化学、热学、光学及电子技术等多f - j 科相互交叉渗透的产物，在工农业生产、 环保、食品工业、医疗诊断等领域得到了广泛的应用。 生物传感器是指用固定化的生物体成分( 如酶、酶组分、感受器、抗原、抗 体、激素、核酸、有机分子等) 或生物体本身( 如细胞、细胞器、细胞膜、组织 等) 作为分子识别元件，对被分析物具有高度选择性的分析仪器，通常包括具有 化学分子识别功能的生物材料、换能器件和信号放大装置等三部分。 生物传感器的原理为【2 j ：当待测物质( 底物、辅酶、酶、维生素、抗原、抗 体、抗菌素等) 经扩散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生化学反 应，产生的信息( 光或热等) 继而被相应的化学或物理换能器转变成可定量处理 的电信号或光信号等并输出，根据输出信号的大小或强弱便可知道所测物质的浓 度。原理见图1 1 。 f d ； 被测物质! 己 酶电极 微生物 、麦电 细胞或 物啾 组织 或化j光电 学变化 ，压电 抗原或 ， f e t 阀 抗体 值电橙 测 量 或 控 制 装 置 转换部件识别舒件 r 一 生物传感器 图1 1生物传感器的原理示意图 f i g 1 一ls c h e m a t i cd i a g r a mo f t h eb i o s e n s o r 第一章绪论 1 1 2 生物传感器的特点 经典的分析技术，如高效液相色谱、气相色谱和质谱等，因费时、昂贵、要 求对样品进行预浓缩等，难以得到广泛应用。生物传感器作为一种新的检测手段， 与之相比有以下的优点f 1 2 】： ( 1 ) 测定范围广泛； ( 2 ) 因生物敏感，膜分子具有高度特异性、灵敏性，且样品用量少； ( 3 ) 样品一般不需要预处理，测定过程简单迅速； ( 4 ) 信号响应快，体积小，可以实现连续在线检测； ( 5 ) 固定化的敏感材料可以反复多次使用，具有较好的稳定性； ( 6 ) 检测时不需加入其它试剂，是一种准确的“无试剂”分析方法； ( 7 ) 成本低，传感器连同测定仪器的成本远低于大型分析仪器，便于普及； ( 8 ) 可进入牛物体内。如安放于静脉或动脉中的葡萄糖传感器能持续不断地监 测血糖含量，并将指令传给植入人体的胰岛素泵，控制胰岛素释放量。 1 1 3 生物传感器的评价 利用生化反应的专一性，高选择性地分析目标物，是发展生物传感器的最初 目的。但由于生物单元的引入，生物传感器的实用化还存在着不少问题，因此需 要对其性能进行综合评价。目前，提高生物传感器的性能主要从三个方面入手【3 j ： 选择性：通过改善生物单元与换能器之间的联系以减少干扰；选择设计 新的活性单元以增加其对目标分子的亲和力。如在酶电极中加入介体或对酶进行 化学修饰可以提高这类电极的选择性。 稳定性：为了增加固定化生物材料的单元结构的稳定性，已有很多人用 合适的溶胶凝胶作为生物单元的固定剂应用于酶电极。 灵敏度：对于一些特定的分析对象已发展了一些能大幅度降低检测限、 扩大线性检测范围的技术。 此外，实现生物传感器的普遍应用，还需使制备的酶电极价格低廉和寿命长。 1 2 酶传感器 1 2 1 酶传感器的发展历程 酶电极是发展最早，也是目前最成熟的一类生物传感器，是电化学生物传感 器最重要的组成部分。它的发展主要包括三个阶段，其机理见图1 2 【4 】o 2 第一章绪论 第一代酶传感器，以氧分子为介质，建立在氧还原基础上，典型的例子是葡 萄糖传感器，它的感应器为含有葡萄糖氧化酶的膜，转换器为氧电极。 第二代酶传感器为介体型酶电极，它是利用人为加入电子媒介体来解决传递 电子的问题，但媒介体的流失、生物相容性以及生物中毒等问题会导致酶电极的 性能有所下降。 第三代酶传感器为直接电化学酶电极。电极的直接电化学可以用纳米金、碳 纳米管、介孔材料等修饰材料实现。与前两代相比，直接电化学酶电极是将酶分 子直接吸附固定到电极表面，是酶的氧化还原活性中心与电极直接“交流”，使 酶电极的响应速度更快、灵敏度更高；直接电化学酶电极电化学过程中的电子传 递不需要介体，降低了系统非特异性反应倾向【4 】。但是酶通常具有较大的分子量， 酶分子的电活性中心深埋在分子的内部，且在电极表面吸附后易发生变形甚至失 活，所以酶与电极间难以直接进行电子转移【5 】。然而，蛋白质直接电化学研究在 生物电化学中具有重要地位，对于蛋白质结构和功能研究、蛋白质电子传递过程 的热力学和动力学研究都有着重要意义，而且是研制第三代电化学生物传感器的 基础【6 】。因此，对酶的直接电化学研究会成为酶电极领域的重要发展趋势。 底物产物 0 2 h 2 0 2 li 1 r中 困 底物产物 底物产物 图1 2 酶传感器的三个发展阶段( 依次为第一代、第二代、第三代) f i g 1 - 2t h r e ed e v e l o p m e n tp e r i o d so fe n z y m em o d i f i e de l e c t r o d e ( t h ef i r s t ，t h es e c o n da n dt h et h i r d , r e s p e c t i v e l y ) 1 2 2 酶的种类与特点 酶的种类很多，人们通常以酶的催化反应性质为酶分类和命名。其中，蛋白 类酶( r 酶) 一般分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶 等。酶电极所采用的酶均为氧化还原酶。 生化研究表明，酶催化与其他物质的催化行为具有相似性，但是它在某些方 第一章绪论 面与其他化学催化剂明显不同，具体表现在以下几点【7 】： ( 1 ) 具有更高的催化反应速率，比一般化学催化剂高1 07 1 0 1 3 ； ( 2 ) 酶来自生物体，反应环境温和，可以为常温、常压和接近中性的p h 环境； ( 3 ) 酶具有高度的特异性，对其催化的对象有高度的选择性，一种酶只作用于 一种或一类底物，而且酶催化反应几乎没有副产物； ( 4 ) 酶催化具有灵活的调节能力，其催化活性不仅取决于底物浓度，而且还取 决于非底物浓度，其调节能力包括结构调节、共价修饰、合成酶数量的变化。 基于酶构建的生物传感器具有反应快速、高特异性、高灵敏度、现场检测等 特点，因而成为国内外研究热点。 1 2 3 酶促反应动力学 酶促反应动力学( e n z y m ek i n e t i c s ) 的研究开始于二十世纪初，它是研究酶 促反应的速度以及影响因素的科学，是酶- t 程研究中的一个重要内容。在不同条 件下酶催化反应速率的变化能揭示出反应物的转化途径，说明反应机制。动力学 数据结合了酶结构和催化机制的信息。 酶是大分子，其分子量一般在一万以上。而酶的底物一般很小，所以直接与 底物接触并起催化作用的只是酶分子中的一小部分。酶分子中的活性中心是由酶 分子中少数几个氨基酸残基构成的，它们在一级结构上可能相距很远，甚至位于 不同的肽链上，由于肽链的盘曲折叠而互相接近，构成一个特定的活性结构。因 此活性中心不是一个点或面，而是一个小的空间区域。 酶和底物键合的非共价力包括范德华力、静电力、氢键和疏水相互作用。通 常，酶分子的表面上与底物结合区有一个缺口或裂缝，正好与底物的形状互补， 称为几何互补；结合区的氨基酸残基排布构成与底物吸引的专一作用方式，称为 中性互补。与底物形状或功能团分布不同的分子不能够有效的与酶结合。此外， 大部分酶的底物结合区在与底物键合时会有一些构型的改变( 诱导楔合) 。1 8 9 4 年e f i s c h e 提出了酶与底物相互作用的钥匙模型，互补性是其基础。 根据过渡状态理论( t r a n s i t i o ns t a t et h e o r y ) ，催化剂通过降低被催化反应的过 渡态自由能而起作用。与其他化学催化剂一样，酶降低了过渡态的自由能，使催 化反应的过渡态变得更加稳定。酶催化基团的排列使得其与底物之间的结合具有 特异性。酶催化的反应机理可以分为酸碱催化、共价催化、金属离子催化、静电 催化、靠近合定向效应、过渡状态配合物的优先选择结合等。 在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶 促反应速度，即底物转化量 5 时的反应速度。影响酶促反应的因素主要有：一 底物浓度 4 第一章绪论 1 9 1 3 年，l e o n o rm i c h a e l i s 和m a u dm e n t e n 在前人基础上，提出著名的计算 反应速率常数的m i c h a e l i s m e n t e n 动力学方程，即米氏方程： v 0 = ( v m a x s 1 ) f k l s l ) ( 、一、) 其中，v o 为反应速率，v m a x 为反应的最大速率，k m 为米氏常数( m i c h a e l i s c o n s t a n t ) ，k m = ( k + k 2 ) k l 。当底物浓度【s 】- k m 时，v 0 = v m a x 2 ，因此，k m 是反 应速率达到一半时的底物浓度。可见，若酶的k m 值小，则它在低底物浓度下即 可达到最大催化效率。 不同浓度的底物与酶的相互作用如图1 3 所示。 八ju a n = s m z b 图1 3 底物与酶相互作用示意图 a ：低底物浓度b ：底物浓度为k mc ：高底物浓度 f i g 1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo fi n t e r a c t i o nb e t w e e ne n z y m ea n ds u b s t r a t e a ：l o wc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ；b ：t h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ：k m ； c ：h i g hc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e 酶浓度【e 】：当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度 成正比，即1 ，= 啦，。 温度：一方面是在一定范围内当温度升高时，反应速度也加快，这与 一般化学反应一样；另一方面，随着温度的升高而使酶蛋白质逐渐变性。酶被固 定化以后其最适温度比天然酶高一些，一般因酶而异，大致提高5 1 5 。 p h ：p h 对酶促反应速度的影响，通常为一钟形曲线，即p h 过高或过 低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的p h 值就称为酶的最适 p h 。 抑制剂：凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统 称为酶的抑制剂。按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用和可逆抑 制作用两大类。 激活剂：酶的激活剂大多数是金属离子，如k + 、m 9 2 + 、m n 2 + 等，唾液 第一章绪论 淀粉酶的激活剂为c l 。 1 2 。4 酶的固定化方法 目前，对酶传感器的研究主要集中于对新载体和新方法以及新机理的探索。 固定化了的酶既具有酶的催化特性，又具有能回收、反复使用等特点，使用寿命 和贮存寿命都比溶液酶长。根据酶与载体材料的相互作用不同一般将固定化酶的 方法分为以下几类【8 】：吸附法、包埋法、共价键法、交联法、共固定化技术等， 下面做一下简单介绍。 ( 1 ) 吸附法：它是指载体通过范德华力、离子键和氢键等亲和力固定化酶。 此法多以无机材料为载体，主要包括多孔玻璃、活性炭【9 1 、氧化铝等。d i a z 等【l o 】 通过对m c m 4 1 固定胰岛素的研究，发现经过静电吸附作用固定在m c m 4 1 上的 胰岛素的稳定性得到明显改善。吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构 变化少的优点，因而酶活力损失少，但是它有酶与载体相互作用力弱、易脱落等 缺点，若能找到适当的载体，这是很好的固定化酶的方法。 ( 2 ) 包埋法：包埋法较为简单温和，酶分子仅仅是被包埋在聚合物或孔道 中，而未参加化学反应，生物活性破坏少，使得酶的活性得到保证，但此法对大 分子底物不适用，且储存稳定性和热稳定性差。 ( 3 ) 共价键法：是酶与载体以共价键结合的固定化方法。归纳起来有两类： 一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上 接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。该方法形成的酶膜厚度与吸附法相似， 且酶电极的响应速度快、稳定性好，酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，无 酶膜脱落和开裂现象。由于酶分子与载体材料表面形成较大的多点结合界面，共 价法的结合力较强，结合效率较高。但是该方法操作复杂，反应条件苛刻，会引 起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，酶活回收率一般为3 0 左右，甚至 底物的专一性等也会发生变化。 ( 4 ) 交联法：为了增加酶负载，进一步提高电极的稳定性，酶与多官能团 试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体( 网状结构) ，交联形成的 固定化酶称为交联酶。与共价结合法一样，两者都是靠化学结合的方法使酶固定 化，其区别在于交联法使用了交联剂，常用的交联剂有戊二醛、鞣酸。单用戊二 醛交联得到固定化酶的方法很少单独使用，将此法与吸附法或包埋法联合使用可 以达到良好的加同效果。例如先用己丁酯吸附，再用戊二醛交联等，但交联剂的 使用会严重降低酶的活性。 ( 5 ) 共固定化技术l ：它是将具有协同作用的两种或多种酶共同固定在一 个载体上，是近年来发展较快的一项技术。这种方法可使组分之间互补催化活性， 6 第一章绪论 发挥它们各自的优势以获得更高效率。m o u s t y 等已将来自t r a m e t e sv e r s i c o l o r 的 漆酶和来自蘑菇的酪氨酸酶共固定化，并吸附在一种类似玻璃的碳电极来持续检 测混合溶液中的叠氮化物和氰化物。 1 2 5 酶的固定化材料 固定化酶的性能取决于固定化酶所使用载体材料的性质和固定化方法，而酶 的固定载体又直接决定酶生物传感器的稳定性及灵敏性等性能。理想的载体要有 高度的热稳定性及化学稳定性、良好的机械强度、对酶的良好生物相容性和结合 力等。为了研制价格低廉、灵敏度高、选择性好和寿命长的酶电极，酶的固定化 已经成世界各国竞相研究和探索的目标。经过几十年的不断工作，已经研究开发 了多种酶的同定化材料。 1 2 5 1 无机材料 无机材料中已经有很多种广泛应用于固定酶，例如硅胶、凝胶、纳米级的金、 银粒子、碳纳米管、介孔材料等。b e s t e m a n 等【1 2 】报道了一种基于单壁碳纳米管的 葡萄糖生物传感器，葡萄糖氧化酶与碳纳米管管壁之间由一种小分子连接，这种 酶覆盖的碳纳米管电极可以作为可逆的p h 传感器。 介孔材料【1 3 j 4 】的出现为酶直接电化学提供了新的机遇，其固定酶电极的研究 如第一章中1 3 5 节所述。但是，目前对介孔材料固定化酶电极的研究尚处于初 级阶段，其对促进电子传递的机理以及实际应用缺乏必要的理论和实验研究。 1 2 5 2 有机聚合物材料 由于有机聚合物合成的灵活性、结构的预设性，使得合成材料的化学、物理 性能都有很大的可调性，从而成就了有机聚合物材料在生物酶固定化方面的重要 作用。叶庆玲等【”】用对苯二酚和甲醛在酸性条件下缩聚而成凝胶状树脂，用于固 定葡萄糖氧化酶有很高的酶活力。 介体型酶电极增加了化学修饰层，扩大了基体电极检测化学物质的范围，同 时也提高了测定的灵敏度，其中应用较多的就是导电聚合物材料，它以其独特的 导电性能和多种制备方法等特点，占据着酶电极研究的重要位置。目前，已经合 成了各种导电高分子材料并用于酶电极的制备如聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩以及各 自的衍生物等。 1 2 5 3 天然生物材料 生物材料特有的生物结构为酶的存活提供了很好的微生物环境，使酶活力保 持率高、寿命长。此类材料的最大优点就是来源广泛、无毒、生物相容性优良， 第一章绪论 常用的有海藻盐、丝素蛋白、壳聚糖及其衍生物【临17 】等。 此类材料不仅可以单独进行酶的固定化，还可以将两种天然聚合物共混或共 聚用于酶的固定化材料，如琼脂糖瓜尔胶复合材料 1 8 - 1 9 】，该材料综合了两者的 优点，不仅能为酶提高天然的微观环境，又能保证酶与电极间的电子传递，从而 为酶电极的研究提供了一种良好的固体化材料。 1 2 5 4 无机有机复合材料 介孔材料以其较高的比表面积、孔体积和介孔结构的规则性等优异性能，既 可以为酶保持催化活性提供良好的微观环境，又能促进电子在酶与电极间的传 递，缺点是其成膜性较差：高分子材料具有良好成膜性和生物相容性，但有的成 膜比较致密，不利于电子的传输。为了构建出性能优异的酶传感器 2 0 - 2 6 】，将无机 材料和有机材料复合，有效的利用两者的优点，在电极构建过程中可以取长补短， 制备出满足一定需要的酶电极。目前已有很多人利用碳纳米管优异的导电催化性 能和壳聚糖良好的成膜性以及生物相容性等优点制备了各种性能优异的酶生物 传感器【2 7 五9 】。 本文所研究的酶电极也采用此类材料，即无机有机复合材料固定化酶修饰 电极，有效的结合介孔碳和聚乙烯醇两种材料的优势，构建了高性能的酶生物传 感器。 1 3 介孔材料在传感器中的应用 1 3 1 介孑l 材料的概念和分类 按照国际纯粹应用化学联合会( i u p a c ) 的规定【3 0 】：多孔材料可根据其孔直 径的大小分为三类，如表1 1 所示： 表1 1多孔材料分类及实例 t a b l e1 - 1c l a s s i f i c a t i o na n de x a m p l e so f p o r o u sm a t e r i a l s 微孔沸石分子筛广泛的应用于离子交换、吸附与分离、催化等领域，然而由 第一章绪论 于孔径的限制，它们对那些与大分子相关的应用无能为力。1 9 9 2 年m o b i l 公司 的研究人员首次合成出m c m 4 1 型中孔分子筛，标志着新型介孔材料的诞生。 介孔材料同样具有规则排列的孔道而且突破了微孔分子筛孔径的限制，显示了很 广阔的应用前景，因此引起了普遍关注。 介孔材料的分类角度一般按化学组成和结构的有序性来区分： ( 1 ) 按照化学组成的角度可分为硅基和非硅基两大类【3 1 1 。前者的骨架主要包括 硅酸盐和硅铝酸盐等，后者主要包括过渡金属氧化物、介孔碳分子筛、磷酸盐和 硫化物等为代表的非氧化物。 ( 2 ) 按照介孔是否有序可分为无序介孔材料和有序介孔材料。其中有序介孔材 料是2 0 世纪9 0 年代初迅速兴起的一类新型纳米结构材料。 1 3 2 介孔材料的特点和改性 有序介孔材料的优越性在于它们具有均一的且在纳米尺寸上连续可调的孔 径、从一维到三维的高度有序的孔道结构、较大的比表面积和孔体积、易于修饰 的表面、稳定的骨架结构、可控的形貌等，可用作吸附剂、催化剂及载体，并在 分离提纯、生物材料、新型组装材料、微电子和光学材料等方面有着巨大的应用 潜力f 3 2 3 7 】；同时介孔材料独特的结构和催化性能为电子传递提供合适的环境，并 防止生物分子的流失，为制备一系列高性能的传感器提供了广阔的前景。但是化 学反应活性不高和稳定性较低等缺点大大限制了介孔材料的实际应用。因此，对 介孔材料进行改性成为介孔材料领域研究的热点课题。 介孔材料的改性包括物理改性和化学改性： ( 1 ) 介孔材料的物理改性： 一般是根据特定的目的，选择相应的某些方面性能好的材料，与介孔材料复 合，例如可以将导电性高的物质与介孔材料复合，结合两者的优势，进一步提高 介孔材料的灵敏度和稳定性。 ( 2 ) 介孔材料的化学改性： 可以通过引入金属离子，使其周围的电荷过剩产生较强的质子酸中心或路易 斯酸中心，或通过金属掺杂后产生离子交换位，将催化活性组分引入，开拓介孔 材料在催化领域中的应用。 具有化学活性的硅醇键是介孔材料表面化学改性的基础，如通过表而硅醇键 与活性组分成键，把催化活性位引入孔道或骨架；也可以利用具有特定官能团的 硅烷偶联剂进行改性。 9 第一章绪论 1 33 介孔材料的合成过程及形成机理 = 攀矗、 彩，；钐= 移 圈1 4 “软模扳”和“硬模板”挂台成介孔材料的示意图 f 嘻1 4s c h e m m i cd i a g r a mo f s y n t h 目i s o f m e s o p o r o 世m m e r i a l sv i a “$ o r t t * m p l m l n g ”a n d h m o t e m p l a t i n g 。 介孔材料合成的主题是围绕着如何去制造“介观限制空间”而展开的。根据 文献报道，“制孔”的方法一般为模板法是人们最常用也是最为有效的方法和 技巧。模板法按模板剂分类，可分为硬模板法( h a r o - t e m p l a t i n g ) 和软模板法 ( s o r - t e m p l a t i n g ) 。采用这两种方法合成介孔材料的过程见示意图l - 4 ，这里的 “软”和“硬”是相对而言的，具体是根据使用的模板剂结构的相对硬度而定的。 1331 硬模板法合成介孔材料 所谓的硬模板法是指所用的模板剂结构相对较硬。一般指固体材料，如介孔 碳材料或者无机纳米晶体等，它们与构成介孔无机骨架物种之间几乎没有相互作 用力而模板剂更多的是作为“空间”中易于除去的“介观填充物”的作用，在 去除硬模板之后产生的是其相应占据的介观空间。 1332 软模板法合成介孔材料 软模板法也称作自组装法或超分子模扳法。软模板法通常以表面活性剂为模 板，利用溶胶凝胶、乳化或微乳化等化学过程，通过有机物和无机物的界面作用 组装生成介观结构的。软模板剂一般是指具有软结构的有机分子或超分子如表 面活性剂或者生物大分子。一般而言需要选择与构成介孔的无机骨架物种之间 能形成较强的相互作用的物质作为模板。在这样的相互作用力下，模板剂能与无 第一章绪论 机物种自组装形成新型的无机与有机复合的介观结构。由于这类组装往往通过软 性物质之间存在的相互作用力，使得人们能够在理解它们作用机理后通过控制它 们之间的作用力等于段对其结构进行控制，所以人们更愿意使用软物质来进行自 组装的设计，它是一种形成高度有序介观结构的重要手段。 对于软模板法合成介孔材料的机理研究很重要，液晶模板机理和协同作用机 理最具有代表性。m c m 4 1 的形成机理见图1 5 。m o b i l 公司的研究者们最早提出 了液晶模板( l i q u i dt e m p l a t i n gm e c h a n i s m ，l c t ) 机理。他们认为表面活性剂生 成的液晶是形成m c m 4 1 介观结构的模板剂，并提出了合成介孔材料的两条路 线，但是这种机理并不适合所有的情况。s t u c k y 等认为介孔材料的介观结构是无 机物种与有机表面活性剂分子的协同自组装( c o o p e r a t i v es e l f - a s s e m b l y ，c s a ) 的结果。该协同组装机理具有一定的普遍性，可以较完美地解释许多实验现象， 尤其可以解释一些表面活性剂相图中不存在的介观结构的形成，例如s b a 2 结构 的生成。 ，“。厂、 ：h 。“。，一 一。一 、。，謦 一 w 。 麓，萨萨移 图1 5m c m - 4 1 的形成机理：液晶模板机理；协同作用机理 f i g 1 - 5t h ef o r m a t i o nm e c h a n i s mo fm c m - 4 1 l i q u i dt e m p