（应用化学专业论文）大孔树脂协同微波技术开发黄酮类天然食品添加剂.pdf

摘要 摘要 随着人们回归自然、渴求健康的要求，天然食品添加剂的需求量不断增加。 我国对食品添加剂需求量很大，但天然食品添加剂生产厂家少，且生产技术落后， 与先进国家有较大差距。因此开发高效率、低成本、产品质量好而安全的天然食 品添加剂的生产工艺和方法既可满足社会需求，又可综合利用植物资源，变废为 宝，提高社会经济效益。 本文对于微波、大孔树脂及表面活性剂协同提取女贞子、腊梅花、灯心草等 中草药总黄酮的工艺条件进行研究。 1 - 对微波提取女贞子总黄酮的新工艺进行研究。结果表明：以原料0 5 0 0g 的女 贞子粉末，提取剂为4 5 的乙醇，提取剂用量为1 ：5 0 ( g m e ) ，微波功率为4 6 4w ， 提取时间为3 0 0s ，提取次数3 为最佳的提取工艺。与溶剂提取法相比，微波提取 女贞子总黄酮的每次提取时间从2 4h 减少为3 0 0s ，提取率从6 1 3 9 提高到 8 3 4 5 。 2 对微波提取腊梅花总黄酮的新工艺进行研究。结果表明：以原料0 5 0 0g 的腊 梅花粉末，提取剂为7 0 的乙醇，提取剂用量为1 ：6 0 ( g m e ) ，微波功率为2 8 8w ， 提取时间为4 5 0s ，提取次数3 为最佳的提取工艺。与溶剂提取法相比，微波提取 腊梅花中总黄酮的每次提取时间从2 0h 减少为4 5 0s ，提取率从7 9 8 6 提高到 9 2 2 3 。 3 通过对比吸附试验确定a b 8 大孔树脂为适合吸附腊梅花黄酮类的最佳吸附树 脂，并通过平行试验找出最佳静态吸附条件：温度3 0 ，吸附时间3h ；动态解 吸条件：流速2 6m l m i n ，上样液p n 为4 3 ，3 0m e 的7 0 乙醇洗脱。 4 通过平行、正交和对比实验对微波技术表面活性剂协同提取灯心草总黄酮的 新工艺进行研究。结果表明：原料0 5 0 0g 灯心草干粉，提取剂为0 0 4 6 5 0 1 5 5 乙醇水溶液，提取剂用量为1 ：4 0 ( g m l ) ，微波功率为4 6 4w ，提取时间为3 5 0s ，提 取次数2 为最佳的提取工艺。与溶剂提取法相比，微波提取灯心草总黄酮的每次 提取时间从2 h 减少为3 5 0s ，提取率从5 9 提高到9 1 。 ，“东丁业人学硕十学位论文 关键词：微波提取；女贞子；腊梅花；灯心草；总黄酮；大孔树脂 a bs t r a c t a st h er e x l u i r e m e n t so fr e t u r n i n gt ot h en a t u r ea n dl o n g i n gf o rh e a l t h ，t h ed e m a n do f n a t u r a lf o o da d d i t i v e si si n c r e a s i n gr a p i d l y a l t h o u g hc h i n ah a sa b u n d a n tn a t u r a l r e s o u r c e sa n dw i t hg r e a td e m a n d t h e r ea r ev e r yf e wm a n u f a c t u r e r so fn a t u r a lf o o d a d d i t i v e s ，m o s to fw h i c ha r el a c ko ft h el a t e s tt e c h n o l o g yo fp r o d u c t t h e r e saw i d e g a p1 1 0m a t t e ri nq u a l i t yo ri nc a t e g o r yb e t w e e nc h i n aa n do t h e ra d v a n c e dc o u n t r i e s ， w h i c hr e s u l t i n gi nt h ei n c r e a s i n gi m p o r ty e a rb yy e a r t h e r e f o r et h er e s e a r c ha n d d e v e l o p m e n to fp r o d u c i n gt e c h n i q u eo fs a f en a t u r a lf o o da d d i t i v e s ，w h i c ha l s oh a st h e c h a r a c t e r i s t i co fh i g he f f i c i e n c y , l o wc o s t ，g o o dq u a l i t y , c a nm e e tt h en e e d so ft h e s o c i e t y i nt h es a m et i m ei tc a l la l s ou t i l i z ef o l i a g er e s o u r c e s ，t u r nt h et r a s hi n t ot r e a s u r e ， a n de f f e c t i v e l yp r o t e c tt h ee c o l o g i c a le n v i r o n m e n t ，i m p r o v et h es o c i a le c o n o m i c b e n e f i t s ，a l lo f s u c hh a sf a r - r e a c h i n gs i g n i f i c a n c e t h e r e f o r e ，i no r d e rt ot a k ef u l l ya d v a n t a g eo fo u rr e s o u r c e s ，t h er e s e a r c ho nt h e m i c r o w a v e ，m a c r o p o r o u sr e s i na n ds u r f a c t a n th c i d u ma s s i s t e d e x t r a c t i o no ft h e f l a v o n o i d sf r o ml i g u s t m ml u c i d u ma i r ，c h i m o n a n t h u sp r a e c o xa n dj u n c o se f f u s e sl h a sb e e nc a r r i e do u tas e r i e so fs t u d i e s 1 an e wm e t h o do fm i c r o w a v ee x t r a c t i o nw a su s e dt oe x t r a c tt h ef l a v o n o i d sf r o mt h e l i g u s t m ml u c i d u ma i t t h ee x t r a c t i o np r o c e s s e sw e r ei n v e s t i g a t e da n dt h eo p t i m a l c o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：r a wm a t e r i a lo 5 0 0gl i g u s t m ml u c i d u ma i t d r yp o w d e r , t h ee x t r a c t i o na g e n t4 5 ( v v ) a l c o h o ls o l u t i o n ，t h er a t i oo fr a wm a t e r i a lt o e x t r a c t i o na g e n tl ：5 0 ( g m l ) ，t h em i c r o w a v ep o w e r4 6 4w ，a n dt h ee x t r a c t i o nt i m e3 0 0s f o rt h r e et i m e s c o m p a r e dw i t hs o l v e n t ，m i c r o w a v ee x t r a c t i o nr e d u c e dt h ee x t r a c t i o n t i m ef r o m2 4ht o3 0 0sa n di n c r e a s e dr a t ef r o m6 1 3 9 t o8 3 4 5 。 2 an e wm e t h o do fm i c r o w a v ee x t r a c t i o nw a su s e dt oe x t r a c tt h ef l a v o n o i d sf r o m c h i m o n a n t h u sp r a e e o x n ee x t r a c t i o np r o c e s s e sw e r ei n v e s t i g a t e da n dt h eo p t i m a l c o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：r a wm a t e r i a l0 5 0 0gc h i m o n a n t h u sp r a e c o x d r yp o w d e r , t h ee x t r a c t i o na g e n t7 0 ( v v ) a l c o h o ls o l u t i o n , t h er a t i oo fr a wm a t e r i a lt o e x t r a c t i o na g e n tl ：6 0 ( g m l ) ，t h em i c r o w a v ep o w e r2 8 8w ，a n dt h ee x t r a c t i o nt i m e4 5 0s i i i 广东1 ：业人学硕十学位论文 f o rt h r e et i m e s c o m p a r e dw i t hs o l v e n t ，m i c r o w a v ee x t r a c t i o nr e d u c e dt h ee x t r a c t i o n t i m ef r o m2 4ht o4 5 0sa n di n c r e a s e dr a t e 丘d m7 9 8 6 t o9 2 2 3 。 3 a d s o r p t i o ne x p e r i m e n t sw e r ei d e n t i f i e db yc o m p a r i n gt h ea b - 8m a c r o p o r o u sr e s i n a d s o r p t i o nl a m e is u i t a b l ef o rf l a v o n o i d ss p e n tt h eb e s ta d s o r p t i o nr e s dt h r o u g ht e s t st o f i n dt h eb e s tb a l a n c ea d s o r p t i o nc o n d i t i o n s ：t e m p e r a t u r e3 0 ，t h ea d s o r p t i o nt i m e3l l ， d y n a m i cd e s o r p t i o nc o n d i t i o n s ：f l o wr a t eo f2 6m um i n ，t h es a m p l ep h4 3 ，3 0m l o f 7 0 e t h a n o le l u t i o n 4 w i t hs u r f a c t a n ta s s i s t e dm i c r o w a v ee x t r a c t i o no ft h ef l a v o n o i d sf r o mj u n c o se f f u s e s l ，t h eb e s ta d s o r p t i o nc o n d i t i o n sw a sf o u n dt h r o u g hb a l a n c ea n do r t h o g o n a lt e s t s ：r a w m a t e r i a l0 5 0 0 9f r a i ld r i e dn o o d l e s ，t h ee x t m c t a n ti so 0 4 6 5 0 1 - 5 5 e t h y la l c o h o l s h u ir o n g y e ，t h ee x t r a c t a n ta m o u n tu s e di sl ：4 0 ( g m l ) ，t h em i c r o w a v ep o w e ri s4 6 4w ， t h ee x t r a c t i o nt i m ei s3 5 0s ，t h ee x t r a c t i o nn u m b e ro ft w ot i m e sf o rt h eb e s te x t r a c t i o n p r o c e s s c o m p a r e sw i t ht h es o l v e n t - e x t r a c t i o np r o c e s s ，t h em i c r o w a v ee x t r a c t i o nf l a i l t o t a lf l a v a n o n e se x t r a c t i o nt i m ee a c ht i m ef r o m2hr e d u c t i o n si s3 5 0s t h ee x t r a c t i o n r a t ef r o m5 9 e n h a n c e st o9 1 k e y w o r d ：m i c r o w a v ee x t r a c t i o n ；l i g u s t n m al u c i d u m k i t ；p r a e c o x ；j u n c o se f f u s e s l ；f l a v o n o i d s ；m a c r o p o r o u sr e s i n 广东t 业大学硕十学位论文 独创性声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在 导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以 标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包 含本人或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。 本学位论文成果是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下取得的，论 文成果归广东工业大学所有。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。 论文作者签名：彳历钇 指导教师签名： 网 i _ - - j 年月 日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 近年来，随着现代科学技术的飞速发展、社会经济和人们生活水平的提高， 人们对天然产物的药用和营养价值认识也逐步深入，“健康、长寿、环保”已成为 世人普遍的心态，研究天然产物中的生理活性成分也成为当前生物学、天然药用 化学研究的热点。如今，人们的膳食营养结构已发生了很大的变化，食物由常规 的营养型，逐渐向滋补、保健型发展，各种各样的保健食品、保健饮料进入消费 领域，人们对天然产物的需求越来越广泛和迫切。 我国是一个传统中药大国，目前在我国发现的中药资源己达1 2 ，8 0 7 种，其中 中药用植物1 1 ，1 4 6 种，是世界上植物资源最丰富的国家之一【1 1 。广东省更是我国 的植物资源大省，充分利用价廉的天然资源开发天然食品添加剂，可合理利用资 源，对轻工、农业的发展以及农副产品综合利用都具有一定的意义。然而天然产 物的成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分，且有些物质含量 甚微，提取时又要求活性成分不能被破坏。传统常用的提取方法( 如煎煮法、回 流法、浸渍法、渗漉法等) 在保留有效成分、去除无效成分方面，存在着有效成 分损失大、耗时长、工序多、提取效率低等缺点，已远远不能满足人们对天然产 物深入研究的需要。如何快速、有效地将活性成分提取出来以及对提取物的进一 步分离纯化已成为天然产物研究的“瓶颈”，特别是近年来人们环保意识的迅速提 高和国家可持续发展战略的实施，更使得开发新的天然产物提取技术成为大势所 趋。 随着人民生活水平的不断提高和对天然食品添加剂的某些生理活性作用的 逐步发现，天然食品添加剂的需求量在逐年递增，欧美、日本等天然产物提取技 术发达的国家，不断改善现有提取技术，市场占有率不断扩大。我国虽自然资源 丰富，需求量很大，但天然食品添加剂生产厂家少，且生产技术落后，产品无论 从种类还是质量上都与先进国家有较大差距，造成产品的进口额逐年上升。表面 活性剂和微波技术联合运用于天然食品添加剂的开发，具有选择性高、生产效率 高、生产工艺简单、投资成本低等特点，可提高产品质量和收率、减少能耗，从 广东t 业大学硕+ 学位论文 而增加产品的竞争力。近年来人们对黄酮类化合物的抗氧化功能和机理进行了比 较深入的研究，证实黄酮类化合物是一种很强的活性氧自由基清除剂，所以黄酮 类化合物的研究日益引起了人们的重视。本文以女贞子、腊梅花和灯心草为原料， 用表面活性剂微波辅助提取中药材中总黄酮并用大孔树脂对其进行分离纯化。 1 2 研究植物天然产物化学和利用的意义 植物天然产物是地球赋予人类的一种可再生资源，实际上就是太阳能的一种 贮存方式，植物接受太阳光辐射，进行光合作用，在其体内合成出多种多样的化 合物f 2 】，其中一些次生代谢产物虽然含量不高，但因为其具有独特的化学结构， 或具有生物活性如药物成分；或具有特殊的香气如香精香料；或具有独到的功能 如天然橡胶、鞣料、紫胶等；或具有鲜艳的颜色如天然色素；或经过适当加工可 以制成人工方法不能合成的特种材料如松香、松节油等。研究植物天然产物化学 有助于人类从分子水平全面了解和认识植物天然产物，从而通过人工合成的方法 定向获得大批量的目标产物造福人类，这些目标产物可能是药物，也可能是有特 种功能的物质，也为我们更好地认识自然和利用自然，提供了一个渠道。2 1 世纪 的今天，人们已经充分认识到植物天然产物及其改性产物具有独特的性质和功 效，充分加以利用是人类社会可持续发展的根本保证。我国自然资源丰富，广东 省更是我国的植物资源大省，充分利用价廉的天然资源开发天然食品添加剂，可 合理利用资源，对轻工、农业的发展以及农副产品综合利用都具有一定的意义。 因此，开发研究高效率、低成本、产品质量好而安全的天然食品添加剂的生产工 艺和方法既可满足社会需求，又可综合利用植物资源，变废为宝，有效保护生态 环境，提高社会经济效益，具有深远的意义。 1 3 植物中有效成分的提取技术 对于天然有机化合物的提取，通常是采用适当的溶剂和方法，将有用成分从 生物组织中溶出转移至所用溶剂中，得到含有用成分的提取液，这一过程即称为 提取。最常用的提取方法为溶剂提取法，包括浸渍法、渗滤法、回流法等。目前， 科学工作者在对传统方法进一步改善的同时，在多学科相互渗透并对其提取原理 及过程深入研究的基础上，己开发出了多种新的提取技术【3 】，主要有破碎提取法、 2 第一章绪论 酶法提取、超临界流体萃取、超声波提取法、双水相萃取法、高速逆流色谱提取、 膜分离提取等等。但这些操作单元往往存在技术缺陷、设备复杂、运行成本高、 适用范围小等问题，其发展和应用都受到限制。因此，本文提出了一种具有选择 性高、操作时间短、溶剂用量少、所得产品中目标组分含量相对较高、对环境污 染小等诸多优点的新的提取方法一微波萃取，其研究结果可广泛应用于生物制药、 食品、化工、农业等领域。 1 3 1 破碎提取 破碎提取技术指在适当溶剂下，利用高速旋转的特殊刀具将物料充分破碎成 匀浆状，从而使植物组织中的成分快速转移至溶剂中，最后通过过滤即可【4 l 。同时， 袁珂等【5 搬据流体力学原理，设计出了一种新型的破碎提取器，该仪器的最大特 点是能够在室温下破碎硬植物，且破碎提取一次仅需1 - 2m i n ，具有提取快速、安 全、节省溶剂，工作效率高等优点。但目前此法的产率并不是很高，且应用范围 也局限于实验研究，要应用于工业化大生产还需进一步的研究。 1 3 2 酶法提取 植物中大部分的生物活性成分被包裹在细胞壁内，而细胞壁的主要组成成分 是由链状结构的b d 葡萄糖以l ，4 p 葡萄糖苷键结合而成的纤维素，根据酶反应具 有高度专一性等特性，选择纤维素酶先将细胞壁的组成成分水解或降解，以破坏 细胞壁的结构，使有效成分充分暴露出来，较大幅度地提高了有效成分的提取率。 近年来，酶法提取技术发展迅速，已应用在更多有价值的成分如色素、香精油、 药用成分、油脂的提取工艺上，且操作简便，浸出条件温和，最终可得到高质量 的产品1 6 】。但酶法在应用过程中应考虑酶在后续处理中所产生的变性问题及其对 萃取基质的影响，不能盲目的使用。 1 3 1 3 超临界流体萃取 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n , s f e ) 技术是八十年代初期才 开始迅速发展的一种先进的提取分离技术，其应用原理是利用超临界流体( s f ) 为 萃取剂，从液体或固体中萃取中待测组分。目前最常用的超临界流体是无色无味 广东t 业大学硕+ 学何论文 无毒的c 0 2 ，它在临界点具有类似气体的扩散系数、液体的溶解力，同时表面张 力为零，能迅速渗透进入固体物质以提取其精华，具有高效、不易氧化、纯天然、 无化学污染等特点，而且由于萃取温度接近室温，特别适合对湿、热、光敏感的 物质及芳香烃物质的提取，最大程度地保持各组分的原有特性【。7 1 。当然，s f e 技术 也存在着局限性，例如：由于c 0 2 的非极性和低分子量的特点，该技术对许多强 极性和分子量较大的成分很难进行有效的提取，且设备一次性投资大，运行成本 高，给其推广应用带来了一定的难度。 1 3 4 超声波提取 植物细胞主要由细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核组成，而天然植物有效成 分大部分存在于细胞质中。由于细胞壁的结构和组成有阻碍有效成分进出细胞的 作用，不利于有效成分的提取，因此，要将封闭在细胞中的目标产物提取出来， 破壁是一步关键性的操作，而现有的机械方法或化学方法难以达到理想的效果。 超声波提取技术主要是利用频率大于2 0 k h z 的超声波所产生的强烈的空化效应， 使植物细胞在溶剂瞬时产生的空化泡崩溃时破裂，加速了有效成分的扩散释放并 与溶剂的充分混合，此外，超声波所具有的机械效应、热效应及乳化、扩散等次 级效应也促使植物中有效成分的溶解，加快了整个提取的过程【8 】。目前，超声波 技术已用于皂苷、生物碱、黄酮、多糖等多种天然有效成分的提取。与常规提取 法相比，此法具有省时、节能、高效等优点，但一般适合于胞内酶或非酶天然产 物的提取，且对设备的要求很高，目前研究仍处于实验室规模【9 】。 1 3 5 双水相萃取 双水相萃取技术的基本原理是生物物质在双水相体系中的选择性分配。两种 不同的水溶性聚合物溶液，当浓度达到一定值，由于高聚物之间的不相溶性，即 高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，具有分离倾向形成双水相体系。此 技术在温和条件下进行简单操作即可获得较高收率，目前主要是应用在分离生物 转化的基因工程药物和抗生素，以及从动物组织提取生化药物等方面，近年来开 始应用于植物活性成分的提取分离。尽管双水相萃取技术具有操作简便、萃取时 4 第一章绪论 间短、条件温和等特点，有望向商业化转化。但目前在应用方面还存在着原料成 本高、纯化倍数低等问题，对于在植物有效成分提取方面的研究也有待加强【1 0 1 。 1 3 6 微波辅助萃取 天然有机化合物的微波提取方法，是使用微波及合适的溶剂在微波反应器中 从各种物质中提取各种化学成分的技术和方法。由于被照射物质的结构不同，吸 收微波能的能力各异，且微波对生物材料具有很强的穿透力，可对被照射的物质 产生深层加热效应，因此，在微波的作用下，待测组分被选择性地加热，细胞的超 微结构也不同程度的遭到了破坏，从而使目标产物与基体分离，进入到萃取溶液 中。此法具有萃取时间短、溶剂用量少，提取效率高等优点，在天然产物有效成 分提取中具有广泛的应用前景【1 1 】。 1 4 黄酮类化合物的研究进展 1 4 1 黄酮类化合物的简介 黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中 产生的一类次生代谢产物【12 1 。它广泛存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、 花、果实等【1 3 】，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样。到目前为止已发现 8 0 0 0 多种。黄酮类化合物因其独特的化学结构而对哺乳动物和其它类型的细胞具 有许多重要的生理、生化作用：一方面，黄酮类化合物具有高度的化学反应性， 例如，它能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用【1 4 】；另一方面，黄酮类化合 物又具有很多重要的药理作用，对许多人类疾病具有治疗价值。它们拥有抑制酶 的活性、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗过敏、抗糖尿病并发症等功能，且无 毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退变性疾病的治疗和预防有重要意义， 它作为弱雌激素，在治疗妇女更年期综合症方面有很好的应用前景。因此，引起 了国内外化学家、药物学家的广泛重视，研究进展很快。 1 4 2 黄酮类化合物的生理活性研究 作为一种天然活性物质，在近几年的研究中发现，黄酮类化合物一样，证实 广东一t ：业人学硕十学位论文 具有防癌抗癌、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗骨质疏松、清除自由基和抗氧化活性、 具有雌激素样与抗雌激素样作用、对酒精中毒的解毒作用和治疗酒依赖的作用、 消炎、止咳、祛痰、镇痛、抑菌、抗高血压、降脂、保肝护肝等诸多功效，可用 来开发为食品、功能食品或药品等，极具开发潜力【1 5 1 。 1 4 3 黄酮类化合物的提取 黄酮类化合物在女贞子、腊梅花、灯心草中的含量比较高，加之女贞子、 腊梅花、灯心草的来源较广，价格低廉，因此可采用超声波提取法、超临界流体 萃取法、酶法提取法、关仿生提取法、膜分离法、热压流体萃取法等多种方法提 科16 1 。目前采用的提取方法有如下： 1 4 3 1 煎煮法 煎煮法即将原料加水乙醇煎煮取汁的方法。由于黄酮分酯溶性和水溶性，所 以用水乙醇作溶剂，因此，将女贞子、腊梅花、灯心草加在水乙醇中加热煮沸， 即可将其中的黄酮提取出来。因为黄酮分子中含有酚羟基，易与f e 3 + 发生阳性反 应，生成紫黑色的络合物，因此在操作时，不宜用铁器。直火加热时最好时常搅 拌，以免原料局部过热，容易焦糊。一般2 3 次，每次2 0 - - 3 0m i n ，煎煮次数及时 间可按投药量和药材质量增减。由于煎煮后，中药材中的多糖及其它粘性成分被 不同程度提取出来，药液比较粘稠，过滤困难，生产时可采用加压和多次过滤的 办法进行。 1 4 3 2 回流提取法 用乙醇作溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失，同时保 证安全。一般少量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器，在水浴中加热回流， 一般保持沸腾2 0 3 0 m i n 后放冷过滤，再在滤渣中加溶剂做第二、第三次加热回流， 直至基本提尽有效成分为止。此法提取效率高，但溶剂消耗量大，成本高。 1 4 3 3 连续提取法 为了弥补回流提取法所需溶剂量大、操作比较繁琐的不足，可采用连续提取 法，实验室内采用索氏提取器进行，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热 时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。 6 第一章绪论 1 4 4 国内外对于黄酮类化合物检测的研究进展 随着科学发展及学科关联性的深入，库伦滴定法、共振散射光谱法、导数 脉冲极谱法、单扫示波极谱法、流动注射法一化学发光、电化学法、免疫化学发 光等分析方法也将逐步应用于天然黄酮类化合物的含量测定，只有在仪器的灵敏 性和精确性方面加以改进，逐渐提高黄酮的含量测定准确性，才能为天然黄酮类 化合物现代化的发展提供技术保证。 对于黄酮的提取及其机理研究都要建立在准确的检测基础上，对此，一些学 者已对黄酮类物质的检测进行了一些研究，取得了一些成果。黄酮类化合物的检 测方法有：紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、荧光光度法、毛细 管电泳法、超临界流体色谱法等方法【1 7 l 。 其中紫外分光光度法具有重复性好、准确、简便、易掌握、无需要复杂的仪 器设备，加之所需试剂便宜易得，因此该方法应用于植物中黄酮含量最为广泛【1 8 】。 黎或等1 9 】【2 0 1 用可见光分光光度法分别测定溪黄草和腊梅花总黄酮时发现加 入显色剂硝酸铝时出现明显沉淀。这表明可见光分光光度法可能不适合于溪黄草 和腊梅花总黄酮含量的测定。经过比较，文中认为紫外分光光度法是一种较理想 的测定方法【2 1 1 ，本文利用紫外分光光度法测定女贞子总黄酮含量，在3 5 9n n l 波 长测定总黄酮含量。 1 4 5 国内外对于黄酮类化合物提取和分离的研究进展 黄酮类化合物存在于植物的花、叶、果等组织中，黄酮甙类以及极性稍大的 甙元( 如经基黄酮、双黄酮、查耳酮等) ，一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或 某些极性较大的混合溶剂如甲醇一水( 质量比1 ：1 ) 进行提取。一些多糖甙类则可用 沸水提取。在提取花青素时，可加人少量酸( 如质量分数为0 1 盐酸) 。大多数黄 酮甙元用极性较小的溶剂，如氯仿、乙醚、乙酸乙酯等提取，对得到的粗提取物 可进行精制处理。常用方法有溶剂萃取法、碱提取酸沉淀法、炭粉吸附法、超声 波提取法、超临界流体萃、层析法等【2 2 1 。 为了获得纯黄酮类化合物，有时需要用柱层析、大孔树脂吸附分离，凝胶层 析技术等。用树脂吸附时，主要取决于树脂的吸附性能。吸附作用的本质是吸附 7 广东i ：业大学硕十学位论文 剂与吸附质分子间的范德华力。例如聚酞胺吸附柱层析在用含水醇作洗脱剂时， 是聚酸胺键与银杏黄酮甙的烃基形成氢键而产生吸附作用，即“氢键吸附”学说， 因而洗脱顺序是黄酮甙比甙元先洗脱，在黄酮甙中又以极性较强的甙元先洗脱。 例如，吸附树脂提纯银杏黄酮的报道有很多【2 3 1 。 1 4 6 女贞子、腊梅花、灯心草等的分布和成分分析 女贞子，属植物女贞( l i g u s t r u ml u c i d u ma i t ) 之干燥熟果实是一味中草药。 产地分布在华中、华南、西北，主产于江苏、湖南等地。主要药用价值有：提高 机体免疫功能、降低眼压、补益肌肤、降血糖血脂、抗菌消炎、护肝和抗癌等作 用【2 4 1 2 5 1 。 腊梅花是腊梅科植物腊梅( c h a m e l a c i u mu n c i n a t u m ) 的蓓蕾，用来治疗感冒 咳嗽的有效良方，价廉易得，广泛分布于广东、浙江等地。其性温昧甘，微苦， 无毒。具解暑生津，开胃散郁止咳之功效，腊梅花中含有花色苷和芦丁、槲皮素 等黄酮类化合物1 2 6 1 。 灯心草为灯心草科植物灯草0 u n c o se f f u s e sl ) 的干燥茎髓或全草。灯心草的化 学成分主要有黄酮苷、甘油酯、三萜类化合物和挥发油等。灯心草在我国分布广 泛，价廉易得。功能：有解毒、清热和清心除烦等功效。主治：淋病、水肿、小 便不利、湿热黄疸、心烦不寐、小儿夜啼、喉痹、创伤。灯心草中含有花色苷和 芦丁、槲皮素等黄酮类化合物 2 7 1 。 腊梅花、灯心草分别在成熟果实、蓓蕾和茎髓中无机营养元素和蛋白质含量 极为丰富，且水浸出率高，耐冲泡。他们中黄酮类化合物的含量极高。黄酮类化 合物在人类健康中的作用是国际上过去十余年来天然药物和健康产品研究开发 的热点之一，它具有清除体内自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎抑菌等多 种奇特功效。黄酮类化合物是植物中的抗氧化活性成分之一，近年来，人们对黄 酮类化合物的抗氧化功能和机理进行了比较深入的研究，证实黄酮类化合物是一 种很强的活性氧自由基清除剂，所以黄酮类化合物的研究日益引起了人们的重 视。 第一章绪论 1 5 微波萃取技术 微波萃取技术( m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n ) 是指使用微波及合适的溶剂在 微波反应器中从各种物质中提取各种化学成分的技术和方法。自1 9 8 6 年匈牙利学 者g a n z l e rk 等【2 8 】报道了利用微波能从土壤中萃取分离有机化合物以来，微波萃取 法以其萃取时间短、选择性好、回收率高、试剂用量少、污染低、可用水作萃取 剂及可自动控制制样条件等优点越来越受到重视，应用范围一直扩展到食品、化 工、农业等领域。近年来，微波萃取法以其独特的提取优势，可以避免长时间的 高温引起成分的分解，开始应用于处理热敏性组分或从天然物质中提取有效成分， 是一种具有良好发展前景的萃取分离方法。 1 5 1 微波及其特性 微波是频率大约在3 x 1 0 6 3 x 1 0 9 h z ，即波长在1m 1n 1 1 1 1 范围内的电磁波。 它位于电磁波谱的红外辐射和无线电波之间，通过离子迁移和偶极子转动引起分 子运动，但不引起分子结构的改变和非离子化的辐射能。微波以直线方式传播， 依介质性质不同，会产生反射、吸收、穿透等光学特性，遇到金属会被反射，但 遇到非金属物质则能穿透或被吸收，这取决于材料本身的几个主要特性：介电常 数、介质损耗系数、比热、形状和含水量等【2 9 】。 微波加热不同于一般的常规加热方式，后者是外部热源通过热辐射由表及里 的传导式加热。微波加热是材料在微波场中由介质损耗引起的体加热，是在传输 过程中遇到不同的介质产生的反射、吸收和穿透现象，是物料中极性分子与微波 电磁场相互作用的结果。微波交变电场振动一周的时间约为1 0 。气1 0 。1 2 s 之间，而 偶极子转向极化与界面极化的时间恰好与微波频率吻合，因此，介质在微波场中 的加热主要是靠这两种极化方式来实现。在外加交变电磁场的作用下，物料内极 性分子极化并随外加交变电磁场极性变更而交变取向，使物质的分子发生激烈的 “摩擦”，从而使能量以热的形式释放出来。 虽然微波可直接进入样品内部而不需要借助某些介质的传导，但进入内部的 深度并非无限的，而是有限的。这是因为电磁波从样品表面进人样品后，能量不 断的被吸收并被转化为热量，场强和功率办逐渐衰减，而在一定的频率下，穿透 9 广东一 = 业大学硕+ 学位论文 深度随介质耗散因子的增加而减少。当样品量较大时，样品的浅内层被微波直接 加热，而深内层只能通过对流( 如沸腾) 和分子间的相互碰撞将样品靠外层的热传 给深内层，所以深内层是通过热传导的方式进行加热【3 0 1 。 因此微波加热的特点是：( 1 ) 选择性高。极性较大的分子可获得较多的微波能， 因而运动速度较快。利用这一性质可选择性地提取一些极性成分：( 2 ) 快速。被加 热的样品往往放在微波透明且为热的不良导体容器中，所以微波不需要加热容器 而直接加热样品，使样品迅速升温；( 3 ) n 热均匀。若微波场是均匀的，样品受热 也是均匀的；( 4 ) 高效。 1 5 2 微波萃取的基本原理 在微波场中，由于不同物质的介电常数不同，吸收微波能的程度各不相同， 其产生的热能及传递给周围环境的热能也不同，这种差异导致基体物质的某些区 域或萃取体系中的某些组分被选择性的加热，使得样品中某些成分从基体物质中 有效的分离，进入到介电常数小、微波吸收能力相对差的萃取剂中。因此，溶剂 的极性对萃取效率有很大的影响，不同的萃取基体所使用的溶剂也完全不同。从 植物物料中萃取精油或其它有用物质，一般选用非极性溶剂。这是因为非极性溶 剂介电常数小，对微波透明或部分透明，微波射线自由透过并到达植物物料的内 部维管束，使细胞内温度突然升高，而且物料内的水分大部分是在维管束内，因 此细胞内温度迅速升高，而溶剂对微波是透明或半透明的，受微波的影响小，温 度较低。连续的高温使其内部压力超过细胞壁膨胀的能力，从而导致细胞破裂， 细胞内的物质自由流出，传递转移至溶剂周围被溶解。而对于其它固体或半固体 试样，一般选用极性溶剂。这主要是因为极性溶剂能更好的吸收微波能，从而提 高溶剂的活性，有利于固体或半固体试样中的某些有机物成分与基体物质有效分 离。 从目前文献有关利用微波萃取法提取天然植物中有效成分的报道来看，微波 萃取法具有很好的发展前景和应用潜力。但是，到目前为止，对于其萃取机理的 研究还很少，很多学者都提出了自己的看法。 p a r e 等提出了微波辅助萃取天然产物中有效成分的假设【3 1 1 。他们认为，生物 材料的内部维管束和腺胞系统由于吸收微波能，导致内部温度突然升高，同时其 1 0 第一章绪论 内部压力也超过细胞壁膨胀的能力，故细胞壁破裂，位于其内的有效成分得以自 由流出，传递转移至萃取介质周围，在较低的温度下被萃取介质捕获并溶解其中。 m i c h a e ls p i r o 和s a ns o o nc h e n 研究了几种溶剂中微波萃取和等温萃取薄荷 叶中精华油的动力学规律，通过拍摄扫描电镜照片，他们发现植物腺体壁在微波 照射下破裂【3 2 1 。他们还研究了在乙醇、正己烷、正己烷和乙醇混合溶液中微波萃 取迷迭香叶中迷迭香油的动力学规律，发现含油腺体壁是否被破坏及破坏的程度 与所用的萃取剂有很大关系。 另有学者提出了如下的动力学过程团：( 1 ) 溶剂分子从溶液主体扩散至植物颗 粒表面；( 2 ) 溶剂分子从植物颗粒表面经过细胞壁和原生质膜或颗粒中的狭小通道 扩散至颗粒内部；( 3 ) 溶质分子溶解于扩散至植物固体颗粒内部的溶剂之中；( 4 ) 溶解了溶质的溶剂分子从植物颗粒内部经过细胞壁和原生质膜或颗粒中的狭小 通道扩散至颗粒表面；( 5 ) 植物颗粒表面的溶质分子由于浓度梯度的存在而从颗粒 表面扩散至溶剂主体。 一般将( 1 ) 和( 5 ) n q 做外扩散过程，( 2 ) 和( 4 ) n q 做内扩散过程，( 3 ) n 做溶解过程。 因溶解是快速的，故整个过程的速度取决于扩散过程。其中，外扩散也叫自由扩 散，速度一般比内扩散速度大得多，而且可以通过一些强制性方法如搅拌等来加 强；这样，内扩散过程就成为提取过程速度控制的关键，内扩散也叫阻滞扩散， 其速度快慢取决于植物细胞内细胞壁和原生质膜或颗粒中的狭小通道对溶剂的 阻滞作用。植物细胞的细胞壁主要是由纤维素构成，并有少量的果胶，细胞膜则 由镶嵌有蛋白质的磷脂构成。新鲜植物的细胞中含有大量的极性水分子，在利用 微波能强化提取的过程中，由于微波本身所具有的强的穿透性，可以对整个物系 几乎同时加热，使得细胞内水分子快速吸收微波能而汽化，当体系温度达到或超 过水的沸点时，细胞内水蒸气压迅速增大，压力超过细胞膜和细胞壁承受力时， 细胞就破裂开来或者在细胞表面出现孔洞和裂纹。同时，由于细胞膜中蛋白质分 子也呈现极性，也能吸收微波能而升温变性，化学结构遭到破坏，细胞膜中出现 空隙或裂纹。所以，微波提取可以使植物颗粒中的部分细胞破裂，从而使溶质快 速溶解到溶剂中，阻滞扩散过程( 2 ) 和( 4 ) 的阻力大大减少。而在对体系进行传统加 热提取时，热由外至里传至细胞壁及细胞膜。当温度升至8 0 以上，此时细胞壁 的果胶成分可部分地溶解于水中，细胞壁慢慢变软，细胞间地排列也没有那么紧 j “东1 ：业人学硕十学位论文 密，同时，由于受热细胞膜中的蛋白质发生变性，从而使细胞膜可能出现裂纹。 这时，溶质在浓度差的推动下就较为容易地穿过细胞膜渗到溶剂中。显然，传统 提取方法对细胞的破坏程度远远不及微波辅助萃取法，而且一般的溶剂加热回流 大多是在常压或接近常压的条件下进行，溶剂温度很难达到5 0 。c 以上。因此，微 波辅助萃取较传统提取法，其提取效率得到提高，有效地强化了提取过程【3 3 1 。国 内有关微波辅助提取法的报道也越来越多。而且微波辅助提取法已列为我国2 1 世纪食品加工和中药制药现代化推广技术之一，也有报道微波萃取用于中草药的 浸取生产线之中，如葛根等。到目前为止，中药研究机构的科研工作者，已经用 微波萃取方法处理上百种中药，主要研究了微波功率、微波辐射时间、药材粉碎 度、提取溶剂、固液比等对提取效率的影响，并且将微波辅助提取法与其它提取 方法进行比较。 1 5 3 微波萃取法与传统提取方法的比较 目前，无论是在国内还是国外，从天然植物中提取有效成分主要采用热提取 法( 煎煮法、回流提取法) 、浸泡提取法( 渗漉法、冷浸法) 及超临界萃取法等 提取方法。其中，对于热提取法和浸泡提取法这两类常规方法而言，常常存在着 费时、费溶剂、效率低、重现性差、提取效率低等不足之处，而且所用溶剂通常 有毒，易对环境和操作人员造成危害；而超临界萃取虽具有节省试剂、无污染等 优点，但是回收率较差，为了获得超临界条件，设备的一次性投资较大，运行成 本高，而且难于萃取强极性和大分子的物质，故寻找一种有效的、稳定的提取方 法显得非常必要。 微波萃取法作为一种新的提取方法，具有设备简单、适用范围广、萃取效率 高、重现性好、节省试剂、污染小等特点，可以避免长时间的高温引起物质的分 解，特别适合于处理热敏性组分或从天然物质中提取有效成分，是一种具有良好 发展前景的萃取分离方法。 对于传统的萃取过程，人们普遍认为能量首先无规则地传递给萃取剂，然后 萃取剂扩散进人基体物质，再从基体溶解或夹带多种成分扩散出来，即遵循加热 半角模式渗透进入基体溶解或央带渗透出来的模式，其能量是通过热传导的方 式由外向罩无规则的进行传递，因此，萃取的选择性差，萃取效率和速度也大大 1 2 排章绪论 降低。虽然有戳的选择性也叫通过改变溶剂的性质或延长溶剂苹取