地中海贫血的研究进展

-地中海贫血的研究进展 张媚媚 (广东第二师范学院生物系 广东广州 510303) 摘要：- 地中海贫血 (-thalassemia),简称 地贫，是由于 珠蛋白基因的缺失或突变功能障碍 导致 珠蛋白肽链合成速率减少或不合成,造成 链和非 链合成不均衡 ,从而引起的溶血性贫 血病,具有高度遗传异质性，在我国广东、广西、海南等省均为高发区。重型 地贫胎儿（Barts 水肿） ，多在妊娠末期胎死腹中或产下即死。因此，在地贫高发区对夫妇双方均为地贫基因携 带者的孕妇，在妊娠早期筛查或中期进行产前诊断，防止重型地贫儿出生，以减少出生缺陷。 关键词：- 地中海贫血；分子基础；临床症状；基因检测 地中海贫血（Thalassemia ， 简称地贫）是一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传 性血液病，于 1925 年有 Cooley 和 Lee 首先描述，最早发现于地中海地区的人群，故称为 地贫，又被称为海洋性贫血或珠蛋白生成障碍性贫血，其致病基因为人类珠蛋白基因，- 地中海贫血（以下称 地贫）是由于 珠蛋白基因的缺失或突变功能障碍导致 珠蛋白肽 链合成速率减少或不合成,造成 链和非 链合成不均衡 ,从而引起的溶血性贫血病 1, 是 我国华南地区最常见的常染色体隐性遗传性血液病之一 2。 地贫广泛分布于全世界，多发 地区为地中海沿岸国家、中东、印度与东南亚广大地区，我国广东、广西、海南等省为高 发区，2004 年广东地区 地贫检出率为 7.30%3。 地贫基因携带者婚配的下一代有 1/4 的机会罹患重型地贫，而且目前对此病尚无有效 的治疗方法。因此，检出 地贫基因携带者是防止患病儿出生，提高人口素质的前提。为 此，本文旨在了解 地贫的发病情况及其基因型分布情况，为遗传筛查和产前基因诊断提 供真实资料，以减少出生缺陷。 1 分子基础和基因类型 1.1 发病的分子基础 地中海贫血是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一。 地贫是具有高度异质性的 单基因遗传病。编码 -珠蛋白链的基因是位于 16 号染色体短臂末端的(16p13. 3-pter ) 珠 蛋白基因簇的成员之一。总长约 29kb 包含 7 个连锁的 类基因或假基因,即有 2 个 基 因(1 、2 ) ,1 个胚胎类基因(2 ) ,3 个假基因(1 、2 、1 ) 和 1 个未知功能 基因() 。其中排列顺序为:5-2-1-2-1-2-1-3。-Thal 主要是由于 -珠蛋白基 因合成的减少或缺失所致。 1.2 地贫的基因类型 f 地贫有缺失型和非缺失型两大基因类型 4，缺失型是我国主要类型，而东南亚缺失 （- SEA） 、右侧缺失（-a 3.7）和左侧缺失（-a 4.2）3是中国人最常见的 地贫缺失类型。 1.2.1 缺失型 地贫-1 ：缺失从 5. 2 kb 到整个基因簇不等,共有 16 种类型,在中国主 要是东南亚缺失型, (-SEA 占 95 %;缺失型 地贫-2 ,缺失可累及 1 个 基因(1 或 2 ) 、部分 2 基因或 2 基因的 5端或 1 基因的 3端。目前已发现 8 种基因型,其中最常见 的两种缺失型为右缺失型(-3. 7 ) 和左缺失型(-4. 2 ) 。 1.2.2 非缺失型 地贫：指用限制性内切酶图谱法未能检出明显的基因缺失,但在其中 可能包括导致基因功能丧失的小片段核苷酸的缺失、插入或碱基替代。至目前共有 40 多 种非缺失型 地贫被报道,在中国南方最常见的是血红蛋白 Constant Spring (Hb CS) 基因 突变及少量 Hb Quong Sze (HbQS) 基因突变。根据基因的缺失或突变情况,临床可将 地 贫分为静止型、轻型、中间型(Hb H 病) 和重型(Hb Barts 胎儿水肿综合征) 。 2 临床症状及危害 我国 地贫依据临床症状的轻重可分为：静止型 地贫（缺失 1 个 基因） ；轻型 地贫（也称标准型 地贫，缺失 2 个 基因） ；中间型 地贫（又称 HbH 病，缺失 3 个 基因） ；重型 地贫（又称 Hb Barts 胎儿水肿综合征，缺失 4 个 基因） ，其中后两者危 害严重。HbH 病可致患者中至重度贫血，肝脾肿大，骨骼变形；Hb Barts 胎儿水肿综合征 可致使胎儿宫内水肿及死胎，可导致严重产科并发症 5。 东南亚缺失型（- SEA/）是我国最常见的缺失类型，它是 Hb Barts 胎儿水肿综合征 和 HbH 病的分子基础。已有报道 95%以上的 地贫缺失类型是- SEA/，该缺失型在人群 中的基因携带约为 4%6。- SEA 基因的纯合子构成 Hb Barts 胎儿水肿综合征，若夫妻双方 同为东南亚缺失型地贫时，其子女有 25%的机会罹患此病。 -SEA/ 与静止型 地贫（- 3.7/ 或 -4.2/）组合都会构成缺失型 HbH 病，若夫妻一方为东南亚缺失型 地贫，另一 方为静止型 地贫时，他们的子女有 25%的机率患 HbH 病。因此，为控制 HbH Barts 胎 儿水肿综合征和 HbH 病胎儿的出生，当夫妻一方被确诊为东南亚 地贫时，遗传咨询告知 另一方做 地贫基因诊断尤为重要。产前基因诊断的目的就是为了避免 HbH 病患儿的出生 和 Hb Barts 胎儿水肿综合征的发生。 3 基因检测 目前对地贫的治疗尚无好的办法，因此对本病重在预防，而应用基因检测技术进行产 前诊断则可以预防重症地贫儿的出生。为此，人群中地贫携带者的筛查、基因诊断和产前 诊断显得尤为重要。 3.1 产前筛查 地贫的初筛主要有血液学指标如血红蛋白含量（HGB） 、平均红细胞体积(MCV)、平均红 细胞血红蛋白含量（MCH）及红细胞分布宽度(RDW)等，结合血红蛋白电泳分析可初步诊断 地中海贫血 7-9 由于红细胞储存于室温时可能会膨胀,MCH 比 MCV 更为可靠。以 MCH 27pg 或 MCV 80fl 为标准,基本可以完全筛查出携带者。当 MCH 或 MCV 小于该标准后, 应进行血红蛋白电泳,若 HbA2 2. 5 % ,则高度怀疑为 地贫基因携带者。如果发现了 Hb H 包涵体,则可以诊断中间型 地贫。同时还应注意血清铁蛋白测定,以排除缺铁性贫 血。 3.2 基因诊断 3.2.1 Southern 杂交：Southern 杂交是研究 DNA 图谱的基本技术，在分析 PCR 产物和遗 传疾病诊断分析等方面有重要价值。本方法用一种或多种限制性内切酶消化基因组 DNA， 用琼脂糖凝胶电泳分离酶解片段，将这些分离后的酶片段大小次序不变地转移至硝酸纤维 膜或尼龙膜上的相应位置，然后与放射性核素标记的 DNA 或 RNA 探针杂交，经放射自显 影确定与探针杂交的酶解片段的大小及位置。 3.2.2 跨越断裂点的 PCR 扩增法 ：通过设计位于突变基因断裂点两侧的 3 个引物，构成 两个独立的、跨越断电的 PCR 体系来鉴别样品的基因型。因 a 基因的缺失使本来正常相距 遥远、位于断裂点侧翼的一对引物变得更近，从而就能通过 PCR 技术扩增出特定长度的 PCR 产物；另一条引物则设计缺失区域内，这样仅在正常或杂合子情况下，才会有特异的 扩增产物出现。 3.2.3 多重 PCR 结合溶解曲线分析： 该技术运用双链 DNA 能特异结合荧光染料 SBR- Green 以及不同双链 DNA 具有不同的解链温度的特点。将 PCR 引物分别设计在断裂点的 侧翼以及断裂点的内部（扩增 和 a2）经单管多重 PCR 后产物行溶解曲线分析，结果显 示- THIA、- SEA、 与 a2 的溶解温度分别为（79.90.2）、 （89.40.5）、 （92.80.2）、 （85.00.2），各地中海贫血基因型特定的溶解温度之间无交叉，成 功的鉴定了各缺失型。该方法具有简捷，快速的特点，且由于整个反应过程均是在闭盖的 情况下进行，降低了污染。同时该技术可检测单碱基的突变、小片段插入或缺失。 3.2.4 多重连接酶依赖探针扩增技术：该技术是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行 定性和定量分析的技术，它利用简单的杂交、连接、PCR 扩增反应，在单一反应管内可同 时检测 40 多个不同核苷酸序列的拷贝数变化。该方法具有重复性好，特异性高等优点，可 同时检测已知与未知的大片段缺失或重复突变。 3.2.5 实时荧光定量 PCR：实时荧光定量 PCR 是目前确定样品中 DNA（或 cDNA）拷贝 数最敏感、最准确的方法。该方法被广泛应用于 DNA 基因表达情况的研究，同时它也可 以用于检测基因拷贝数的变化。该技术同 MLPA 技术一样能同时检测已知与未知的大片段 缺失，因此它能弥补传统地中海贫血基因检测的缺陷，提高诊断率。从而能更有效的对地 中海贫血进行产前筛查。 3.2.6 PCR 结合限制性内切酶酶谱分析（ PCR-RFLP）:如果突变产生或消除了一个限制性 内切酶切位点，用特异的限制酶酶切 PCR 产物后经电泳分离、溴乙锭染色，可直接根据观 察到的条带的长度差异作出诊断。该方法具有简捷、快捷、经济的特点。但这一方法只限 于涉及限制性内切酶位点改变的突变和小片段缺失的检测。 3.2.7 多重扩增不应突变系统：ARMS 原理为针对各突变位点设计相应的引物，通过扩增突 变特异性长度的片段，然后根据产物片段大小来区分各突变。该技术简便，快速，对仪器 要求低，只需简单的 PCR 扩增与琼脂糖凝胶电泳，它同 Gap-PCR 一样，被广泛地应用于 a 地中海贫血的基因检测。 4 结语 我国是一个多民族的人口大国，人口问题显得非常重要。人口问题不仅是要有计划地 控制人口数量增长，更为重要的是不断提高人口素质。 地中海贫血是我国广东、广西、 海南等省最常见的遗传病之一，严重危害着广大人民的健康，特别是经济生活水平相对落 后的地区，人们对其重视程度不足，许多地区特别是农村地区对该病毫无了解。而且目前 又无有效的根治方法，因而对于 地中海贫血高发地区，应通过宣传教育和遗传咨询指导 婚配，对高危人群进行婚前、孕前和产前的地贫筛查和基因诊断，应建议于妊娠早中期行 产前诊断，其结果为重型地贫者应建议及时终止妊娠，避免重型 地贫儿的出生，以达到 优生优育，提高当地人口素质的目的。 参考文献 1Higgs DR, Vickers MA, Wilkie AOM, et al. A review of the molecular genetics of the human - globin gene cluster.Blood，1989，73（4）:1081-104. 2区小冰,黄钰君,张力,等.小儿 复合型地中海贫血基因诊断及临床表现 J.临床血液学杂志:输血与检 验,2007,8(4):147-149. 3杜传书.地中海贫血研究的现状与未来J.中华医学遗传学杂志,1996,13(5):257-258. 4黄义强.地中海贫血孕妇的产前筛查与基因诊断研究.亚太传统医药 J.2010，5 (9):101102 贴 5刘秀莲,王洁,赵振东,等.海口地区 89 例 -地中海贫血基因型的研究A. 生命科学研究,2012,10,第 16 卷 第 5 期. 6XU X M, ZHOU Y Q, LUO G X, et al .The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassaemia in Guangdong Province: implications for the future health burden and population screeningJ. American Journal of Clin