高考生物一轮复习第十单元第48课基因工程的基本工具和操作程序课件

第48课基因工程的基本工具和操作程序第十单元生物技术与工程·学业质量水平要求·1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测、鉴定等步骤。考点一重组DNA技术的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照____________，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性。(2)目的：创造出更符合人们需要的新的__________和__________。(3)水平：____________水平。(4)基础：__________、分子生物学和__________等学科。人们的愿望转基因生物类型生物产品DNA分子生物化学微生物学2．基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端(2)DNA连接酶——“分子缝合针”①作用：将限制酶切割下来的DNA片段______________________，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的____________。

②类型常用类型E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源__________T4噬菌体特点只缝合__________缝合__________________拼接成新的DNA分子磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端和平末端(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”①作用：将__________送入受体细胞中。②种类：质粒、噬菌体和____________等。③条件a．具有一个至多个________________，供外源DNA插入其中。b．能在受体细胞中进行__________，或整合到受体DNA上，随受体DNA__________。c．具有__________，便于重组DNA分子的筛选。外源基因动植物病毒限制酶切割位点自我复制同步复制标记基因3．DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的____________方法对它们进行提取。①DNA不溶于______。②DNA在不同浓度的____________中溶解度不同，它能溶于___________的NaCl溶液。③在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现蓝色。物理或化学酒精NaCl溶液2mol/L二苯胺(2)实验步骤1．DNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来。(

)2．E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(

)3．限制酶也可以识别和切割RNA。(

)4．质粒是小型环状DNA分子，是基因工程中常用的载体。(

)5．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(

)6．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(

)7．DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。(

)×××√×××1．(选择性必修3P71旁栏思考改编)限制酶来源于原核生物，不能切割自己的DNA分子的原因是_____________________________________________________

_________。2．(选择性必修3P72旁栏思考改编)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用区别是

_______________________________________________________________________________________________。原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链的末端考向1|

基因工程中工具酶的应用1．(2024·江苏淮安统考)基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是(

)A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通过E.coliDNA连接酶相互连接B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成C．限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′-末端D．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接√B

解析：限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接平末端的效率较低，A错误。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键，B正确。一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个游离的5′-末端，C错误。若两种限制酶的识别序列相同，但由于识别的位点不同，切割形成的末端不同，则不能通过DNA连接酶相互连接，D错误。与DNA有关的酶的比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将链状DNA切成两个片段，将环状DNA切成一个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端2．(2024·重庆联考)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接√C

解析：酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。限制酶的选择

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端或平末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。考向2|

基因工程中载体的应用3．作为基因工程的运输工具——运载体，必须具备的条件及理由是(

)A．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达B．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合C．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便目的基因能够稳定的存在和扩大数量D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择√C

解析：质粒等运载体应具有多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，A错误；质粒等运载体应具有某些标记基因，以便筛选含有目的基因的受体细胞，B错误；质粒等运载体应能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便目的基因能够稳定的存在和扩大数量，C正确；质粒等运载体必须具有某些标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择，D错误。4．(2024·陕西渭南模拟)质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。质粒上的标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同，右图表示外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(

)

A．①是c；②是b；③是a

B．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是a

D．①是c；②是a；③是b分类细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况细菌在含四环素培养基上生长情况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长√A

解析：第①组：细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏，由此可知，外源基因插入的位置不是a、b，而是c。第②组：细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因被破坏，由此可知，外源基因插入位置是b。第③组：细胞不能在含氨苄青霉素培养基上生长，能在含四环素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏，抗四环素基因没有被破坏，由此可知，外源基因插入的位置是a。故选A。分类细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况细菌在含四环素培养基上生长情况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长细胞膜上的载体(蛋白)与基因工程中的载体的两个“不同”(1)化学本质不同①细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质。②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。(2)功能不同①细胞膜上的载体的功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。考向3|

DNA的粗提取与鉴定5．(2023·广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(

)A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色√D

解析：裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，其能溶于2mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后沸水浴5min，待冷却后，溶液呈现蓝色，D错误。6．下图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是(

)A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大√D

解析：DNA的粗提取和鉴定步骤是加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA的滤液→去除滤液中杂质→DNA的析出→鉴定，因此题图中正确的实验操作顺序是③→②→①→④→⑤，A错误；猪血成熟的红细胞中没有细胞核，提取不到DNA，用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不相同，B错误；⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是实验组，出现蓝色则证明该丝状物的主要成分是DNA，C错误；步骤①的目的是析出并获得DNA，步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，D正确。考点二基因工程的基本操作程序1．目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞______或获得预期__________等的基因。性状表达产物(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知____________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用___________和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取①人工合成__________。②常用______特异性地快速扩增目的基因。③构建__________获取目的基因结构和功能序列数据库目的基因PCR基因文库过程说明图解变性温度超过_______时，双链DNA解聚为单链

复性温度下降到_______左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链

(4)利用PCR获取和扩增目的基因①原理：____________。②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。③扩增过程90℃50℃DNA聚合酶DNA复制④PCR技术与体内DNA复制的比较⑤PCR中引物设计应注意的问题a．设计引物的依据：目的基因两端的核苷酸序列。b．引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′-端加上限制酶的酶切位点。c．使用的一对引物的序列不相同，因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。d．引物设计的要求(或引物失效的原因)：每种引物内部不能发生局部碱基互补配对；两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。e．每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。f．两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。g．两种引物都结合在DNA模板链的3′-端；脱氧核苷酸连接在引物的3′-端进行延伸。2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因___________________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用RNA聚合酶转录在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代3．将目的基因导入受体细胞(1)转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)转化的方法类型常用方法常用受体细胞转化过程植物农杆菌转化法、花粉管通道法体细胞将目的基因插入Ti质粒的_________中→转入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达动物显微注射法________将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→胚胎移植→获得具有新性状的动物微生物Ca2+转化法原核细胞Ca2+处理细胞→感受态细胞(细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)→重组表达载体(DNA分子)与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子T-DNA受精卵(3)筛选出含有目的基因的受体细胞①原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如上图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。②被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。③筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如上图1、2、3、4、5菌落。再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如上图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如上图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。4．目的基因的检测与鉴定(1)分子水平检测(2)个体水平鉴定例如：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。检测方法检测目的判断标准_________和电泳鉴定目的基因是否插入转基因生物的染色体DNA上是否出现相应的电泳条带或是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA________________技术目的基因是否翻译出蛋白质是否出现杂交带PCR扩增抗原—抗体杂交5．DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验原理①PCR原理：利用了_____________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的____________等有关。DNA的热变性相反大小和构象(2)实验步骤离心管(3)DNA的电泳鉴定(4)成功扩增出DNA片段的判断依据是可以在紫外灯下直接观察到DNA条带。微量移液器紫外灯1．基因表达载体中含有启动子和密码子。(

)2．检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(

)3．将重组表达载体导入动物受精卵常用基因枪法。(

)4．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。(

)5．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(

)6．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。(

)7．从大肠杆菌细胞中获得了人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。(

)×√×√√√×1．(选择性必修3P78图3-5延伸)自然界中的DNA复制和PCR都需要引物的原因是___________________________________________________________________

___________________________________。2．(选择性必修3P79旁栏思考)用PCR不可以扩增mRNA的原因是____________

________________________________________________________________________________________。在DNA合成时，DNA聚合酶只能从已有的脱氧核苷酸链的3′-端开始连接脱氧PCR是用DNA核苷酸，从5′-端到3′-端延伸子链双链做模板，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再进行PCR考向1|

PCR技术与应用分析1．(2024·黑龙江大庆统考)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(

)A．引物A、B的碱基不能进行互补配对B．复性的目的是让引物与单链DNA相结合C．延伸时，DNA聚合酶从引物的3′-端连接脱氧核苷酸D．第二轮循环后，同时含有引物A、B的DNA占100%√D

解析：如果引物A和引物B发生碱基互补配对则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；延伸时，在DNA聚合酶的作用下，将4种脱氧核苷酸加到引物的3′-端，C正确；DNA复制为半保留复制，第二轮循环即DNA复制2次，共形成22＝4个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段占50%，D错误。2．下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是(

)

A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③D．物质③的5′-端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物√D

解析：根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，题图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，再通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度使子链沿着引物的3′-端延伸，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8个，则需消耗引物③的数目为(8×2－2)÷2＝7个，C错误；物质③的5′-端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D正确。PCR过程的两点提醒(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。考向2|

目的基因的获取及表达载体的构建3．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与________植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和______进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________。野生型载体启动子和终止子(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图甲)，用于后续验证突变基因与表型的关系。

①农杆菌转化T1代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了______________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约____%的培养基中幼苗继续培养。DAI基因和卡那霉素抗性基因75③将②中选出的T2代阳性植株______(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_____%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物。通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息如图乙，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。自交100解析：(1)突变后的基因为隐性基因，所以将DAI基因导入突变体植株后，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小与野生型植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DAI基因，用同种限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割、用DNA连接酶将两者连接；为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①因为选择的是单一位点插入的植株，所以能在卡那霉素选择培养基上生长的阳性个体的基因组中插入了卡那霉素抗性基因和DAI基因。②假设控制种子大小这一性状的基因用A/a表示，T1代阳性植株是单一位点插入的植株，类似于显性杂合子(Aa)，所以自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，应该选择基因型为A_的植株，即选择阳性率为75%的培养基中幼苗继续培养。③步骤②中选出的T2代阳性植株中既有纯合子(AA)又有杂合子(Aa)，所以需要进行自交，所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为纯合子，是目标转基因植株。由图乙可知，限制性内切核酸酶X可以将突变基因切割为50bp和100bp两个片段，而野生型基因无限制酶X的切割位点，故电泳图具体酶切结果见答案。(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。(3)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。考向3|

将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定4．(2024·辽宁沈阳模拟)生长素参与植物生长发育的调节，生长素运输蛋白(PINI)对IAA的极性运输具有重要作用。为研究35S启动子(一种来自病毒的强启动子)能否引起下游基因的过量表达，研究人员将35S启动子与PINI基因转入拟南芥，观察PINI过量表达对植物的影响。(1)获取PINI基因的mRNA后，通过RT-PCR扩增获取PINI基因(DNA)时所需要的酶是_______________________。每次PCR循环分为3步，其中所需温度最低的一步称为______。(2)PINI基因不能直接导入受体细胞，需要构建PINI表达载体。构建PINI表达载体的目的是________________________________________________________________

__________________________________。利于PINI基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；利于PINI基逆转录酶、DNA聚合酶复性因在受体细胞中表达和发挥作用(3)为将PINI基因以正确方向插入质粒需要双酶切。在设计引物时，需在引物的5′-端加入相应的酶切位点。已知PINI基因的1链为转录的模板链，据下图分析，引物1和引物2的酶切位点分别为_____________________________，理由是_____________________________________