微生物的生长及其控制

第六章

微生物的生长及其控制概论生长：细胞物质不可逆地增加，体积增大的过程。（量变过程）繁殖：生命个体数量增加的过程。（质变过程）群体生长：指在一定时间和条件下细胞数量的增加；实质上包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程。

群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长

→个体繁殖→群体生长单个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长第一节测定生长繁殖的方法一、测生长量：单位时间里微生物重量上的变化（一）直接法（精确的称干重法；粗放的测体积法）（二）间接法（比浊法，生理指标法）将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来，然后烘干（干燥温度可采用105℃、100℃或80℃）、称重。一般干重为湿重的10%～20%，而一个细菌细胞一般重约10-12～10-13g。该法适合菌液浓度较高的样品。（一）直接法（二）间接法1.比浊法：借助于分光光度计，在一定波长（450-650nm波段)下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。原理：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。特点：快速、简便。浊度仪2.生理指标法测含氮量：蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。其他方法：含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产CO2、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。二、计繁殖数：单细胞微生物细胞个体数目的检测法1.直接法：

(1)计死活总菌数：显微镜下计数

(2)死活菌分别计数：

酵母：美蓝染色，活细胞无色，死细胞蓝色

细菌：丫啶橙染色，活细胞有橙色荧光，死细胞发绿色荧光细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml2.间接法：是一种活菌计数法(1)平板菌落计数：好氧菌、厌氧菌均可（实验）

菌样稀释→浇注平板→倒置培养→统计菌落形成单位cfu→乘以稀释倍数→菌样含菌数

用活菌指示剂TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)可使菌落在短时间内形成玫瑰红色——快速鉴定(2)厌氧菌的菌落计数法亨盖特滚管培养法和半固体深层琼脂法第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长

1、同步培养（synchronousculture）：即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂同期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。

2、同步生长（synchronousgrowth）：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的生长状态，称同步生长。方法：①环境条件诱导法：氯霉素抑制细菌蛋白质合成；细菌芽胞诱导发芽②机械筛选法：过滤法；离心法；膜洗脱法

二、单细胞微生物的典型生长曲线1、典型生长曲线：

生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。典型生长曲线：将菌种接种在液体培养基中隔一定时间取样，计算菌数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标作图，绘出一条包括延滞期、指数期、稳定期和衰亡期四个阶段的曲线。

R(生长速率常数)=分裂次数(代)/单位时间（一）延滞期（lagphase）

或停滞期--“万事开头难”1.特点：细胞数目不增加(R=0)细胞长、大细胞内RNA尤其是rRNA含量增高合成代谢旺盛，诱导酶迅速合成对不良条件敏感2.影响延滞期长短的因素菌种接种龄：即“种子”的群体生长年龄，即处在生长曲线上的哪一个阶段。接种量：接种量的大小明显影响延滞期的长短。培养基成分：接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组分培养基中的延滞期短。种子损伤度3.产生原因①接种后，新的培养基与原来的培养基成分不同，细胞需要时间合成新的酶来利用新的营养物质；②接种后，细胞内的一些关键小分子、离子或酶由于稀释作用导致浓度下降，恢复到原来水平需要时间；③种子较老，缺乏ATP，必需的辅助因子及核糖体；④细胞可能受损伤而需要一段时间恢复。（二）指数期（exponentialphase）或对数期1.特点：生长速率常数最大，繁殖数>死亡数细胞每分裂一次所需的时间——代时（generationtime，G，增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增时间（doublingtime）最短。细胞平衡生长，成分均匀酶系活跃，代谢旺盛。2.三个重要参数一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli

牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes

组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis

乳糖肉汤 37 48Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 12003.影响指数期微生物代时长短的因素菌种：代时随菌种而异营养成分营养物浓度：营养物在低浓度时影响菌体的生长速率，在高浓度时影响菌体的生长量。凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物，称生长限制因子。培养温度4.对数生长期的意义①研究代谢和生理性能的好材料；②生产中用其作种子；③增殖噬菌体的最佳宿主（三）稳定期（stationaryphase）或恒定期

1.特点：细胞数目不增加(R=0)，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系。2.稳定期到来的原因主要是：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如C／N比值不合适；酸、醇、毒素或H20等有害代谢产物的累积；pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。3.稳定期的意义①若以生产菌体或次级代谢物为目的，稳定期是最佳收获期。②对生物测定来说，稳定期是最佳测定时期。（四）衰亡期（declinePhase或deathPhase）1.特点：个体死亡的速度超过新生的速度(繁殖数<死亡数)，整个群体就呈现出负生长（R<0）细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物在芽胞杆菌中，芽胞释放往往也发生在这一时期2.产生原因营养物质耗尽、有毒代谢产物的大量积累、理化环境的不利。分解代谢速度>>合成速度，大量菌体死亡。生长特点成因菌体特征应用及其它调整期对数期稳定期衰亡期不立即繁殖繁殖速度最快出生率等于死亡率,活菌数最大,代谢产物大量积累死亡超过繁殖适应新环境条件适宜生存条件开始恶化生存条件极度恶化代谢活跃,体积增长较快个体形态和生理特性稳定有些种类出现芽孢出现畸变与菌种和培养条件有关生产用菌种科研材料改善和控制条件,延长稳定期细胞裂解释放产物单细胞微生物生长的四个时期三、微生物的连续培养连续培养（continuousculture）又称开放培养（openculture），是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的单批培养（batchculture）或密闭培养（closedculture）而言的。单(分)批培养：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养：当微生物培养物进入对数期或稳定期后，连续供给其新鲜培养液，同时不断地移出多余的培养液和代谢产物，从而使微生物始终处于较适宜的条件下生长繁殖，这种方式叫连续培养。单批培养恒浊法恒化法单批培养 连续培养 时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养原理：通过认识稳定期到来的原因，并采取相应的有效措施：反“稳定期”的到来。连续培养器的类型恒浊器（turbidostat）这是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液浊度保持恒定的微生物细胞的连续培养器。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长。不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定

恒化器（chemostat或bactogen）：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖的一种连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的。保持恒定的流速,使营养物质浓度保持恒定装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌液密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高速率大量菌体或与菌体生长平行的代谢产物生产为主恒化器培养液流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高速率不同生长速率的菌体实验室为主恒化器与恒浊器的比较和单批培养相比，连续培养的优点有：①高效：减少设备清洗、准备和灭菌等非生产时间，提高了设备利用效率②便于自控③产品质量相对稳定连续培养法的缺点：①需要专门仪器，投资高②由于是开放系统，加上反应周期长，容易染菌③在长周期连续培养中，菌种易于退化④营养物的利用率一般低于单批培养新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用四、微生物的高密度培养（highcell-densityculture,HCDC）指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物。高密度培养的方法主要有：选取最佳培养基成分和各成分含量补料提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成保持合适pH第三节影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的外界因素很多，除了营养因素之外，还有许多理化因素，如：O2、温度、pH值、水活度、渗透压、辐射、UV、电离辐射、超声波、化学药剂等。一、温度温度对微生物的影响具体表现在直接影响细胞内的各种生化反应：影响酶活性：温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性：温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输。影响物质的溶解度，对生长有影响。最低生长温度：一般在-10℃～-5℃，极端的可达-30℃。最适生长温度最高生长温度：一般80-95℃，极端的

105-150℃。

最适生长温度：某菌分裂代时最短、生长速率最高的温度。嗜冷菌：<20℃中温菌：20-45℃嗜热菌：>45℃生长温度的三基点对于同一微生物来说，其不同的生理生化过程有着不同的最适温度。也就是说，最适生长温度并不等于菌体生长量最高时的培养温度；也不等于发酵速度最高时的培养温度；更不等于积累某一代谢产物量最高时的培养温度。二、氧气1.微生物与O2关系2.厌氧菌受氧毒害机制五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态（模式图）三、pH值pH值可影响微生物的生长和改变微生物的代谢产物。pH值对微生物的影响主要作用于：影响细胞膜的电荷分布，从而影响对营养物质的吸收；影响酶的活性，从而影响代谢过程；影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质的吸收或有毒物质的毒性。不同微生物对pH要求不同微生物的生长pH值范围极广，从pH<2-->10都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.0~9.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。

微生物名称 pH值 最低最适最高Thiobacillusthiooxidans氧化硫硫杆菌

0.5 2.0~3.5 6.0Lactobacillusacidophilus嗜酸乳杆菌

4.0~4.65.8~6.6 6.8Rhizobiumjaponicum大豆根瘤菌

4.2 6.8~7.0 11.0Azotobacterchroococcum圆褐固氮

4.5 7.4~7.6 9.0Nitrosomonassp.硝化单胞菌

7.0 7.8~8.6 9.4Acetobacteraceti醋化醋杆菌

4.0~4.55.4~6.3 7.0~8.0Staphylococcusaureus

金黄葡球菌

4.27.0~7.5 9.3Chlorobiumlimicola泥生绿菌

6.0 6.8 7.0Thurmusaquaticus水生栖热菌

6.07.5~7.8 9.5Aspergillusniger黑曲霉

1.55.0~6.0 9.0一般放线菌 5.0 7.0~8.0 10.0一般酵母菌 3.05.0~6.08.0不同微生物的生长pH值范围注意：虽然微生物外环境的pH值变化很大，但细胞内环境的pH值却相当稳定，一般都接近中性。微生物的生命活动对环境pH值的影响固体培养法液体培养法好氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养试管培养三角瓶（摇瓶）台式发酵罐高层琼脂柱厌氧培养皿厌氧罐厌氧手套箱第四节微生物培养法概论一、实验室培养法亨盖特滚管技术

<>

厌氧罐anaerobicjarAnaerobicGloveBox二、生产实践中培养微生物的装置

固体培养法好氧菌-曲法培养厌氧菌-堆积培养液体培养法浅盘培养深层液体通气培养（发酵罐）一、基本概念第五节有害微生物的控制1.灭菌2.消毒3.防腐4.化疗灭菌（sterilization）：是指采用强烈的理化因素，使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称为灭菌。分杀菌和溶菌。消毒（disinfection）：指采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。防腐（antisepsis）：是指采用某种物理,化学或生物因素,抑制物体上的微生物进行生长繁殖,从而达到防止食品等发生霉腐的措施。处理方法有:低温、缺氧、干燥、高渗、高酸、高醇、加防腐剂等。■化疗（chemotherapy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力（对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。二、高温灭菌

湿热灭菌效力高的原因：

1)有水，蛋白质易凝固

2)热蒸汽的穿透力强

3)蒸汽有潜热存在(一)干热灭菌

1.干烤条件：150-170℃，维持1-2h。效果：可杀死细菌的芽胞，如梭状芽胞杆菌。应用范围：用于玻璃器皿、金属用具等的灭菌。

2.灼烧灭菌利用火焰直接把微生物烧死应用范围：适合于对接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物尸体等的灭菌。(二)湿热灭菌

1.常压法

(1)巴氏消毒法用较低的温度处理不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料，以杀灭其中的无芽胞病原菌，又不影响其原有风味的消毒方法。适用于牛奶、啤酒、果酒和饮料等液态食品巴氏消毒条件：低温维持（LTH）法：63℃，30min

高温瞬时（HTST）法：72℃，15s

目前一般都采用超高温灭菌法（ultrahightemperature,UHT）：135-150℃，2-6s(2)煮沸消毒法条件：100℃，加热10-30min。应用范围：饮用水、注射器、毛巾及解剖用具的消毒；水果罐头、果酱等食品。(3)间歇灭菌法条件：80-100℃,加热15-60min,冷却后37℃保温,重复三次效果：可杀死全部细菌及芽胞。应用范围：不耐热培养基灭菌。

2.加压法(1)加压蒸汽灭菌法条件：121℃（压力1kg/cm2），15-20min，或115℃，35min。效果：可杀死全部细菌,大多数孢子应用范围:实验室、医院、发酵工厂器材、物料及肉类、蔬菜、奶制品灭菌。(2)连续加压蒸汽灭菌法条件：135-140℃，5-15s

效果：可基本达到无菌应用范围：发酵工厂培养基及液态食品奶、果汁、蔬菜汁灭菌。（三）影响加压蒸汽灭菌效果的因素

A、物体含菌量

B、排冷气程度

C、PH值

D、体积

E、加热和散热程度如灭菌对象是砂土、石蜡油等体积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长时间。在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气。（四）高温对培养基的有害影响及其防止

1、有害影响

(1)形成沉淀物：多肽类、磷酸盐、碳酸盐等。

(2)破坏营养，提高色泽：产生氨基糖、焦糖或黑色素——褐变

(3)降低PH值

(4)降低培养基浓度：气温低时增加冷凝水2、防止措施（1）采用特殊加热灭菌法：分别灭菌后再混合；低压或间歇灭菌；瞬时灭菌。（2）过滤除菌：使用滤膜或过滤器，如烧结玻璃板、石棉板,硅藻土过滤器等,缺点是无法去除病毒和噬菌体。（3）其它方法：易发生沉淀的，按配方逐一加入成分；加0.01%EDTA或0.01%NTA（氮川三乙酸）防止金属离子沉淀；用氧化乙烯对个别成分灭菌。三、化学杀菌剂、消毒剂、治疗剂关于化学性试剂的药效和毒性的指标

1.最低抑制浓度（MIC）：评定某化学药物药效强弱的指标。指在一定的条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度。2.半致死量（LD50）：评定某药物毒性强弱的指标。指在一定条件下，某化学药剂能杀死50%实验动物时的剂量。3.最低致死量（MLD）：评定某药物毒性强弱的另一指标。指在一定条件下，某化学药剂能引起实验动物群体100%死亡率的最低剂量。(一)表面消毒剂对一切活细胞都有毒性、不能用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂石炭酸系数：在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效石炭酸的最高稀释度的比率。作用机理①使微生物蛋白质凝固变性，发生沉淀。如酒精等；②破坏菌体的酶系统，影响菌体代谢。如过氧化氢等；③降低微生物表面张力，增加细胞膜的通透性，使细胞发生破裂或溶解。如来苏儿等酚类物质。

类型

名称及使用方法

作用原理

应用范围

醇类70%—75%乙醇脱水、蛋白质变性皮肤、器皿

醛类0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白质变性房间、物