临床免疫学检验专家讲座

临床免疫学检验免疫学检验惯用技术临床免疫学检验第1页免疫学检验惯用技术免疫比浊技术生物素与链酶亲和素应用技术金标识酶免分析技术免疫电泳技术抗体提取纯化技术放射免疫分析技术免疫荧光测定技术酶联免疫吸附试验化学发光免疫分析技术免疫印迹技术流式细胞术临床免疫学检验第2页金标识酶免分析技术金标识免疫分析技术也称免疫胶体金技术，利用硝酸纤维素（NC）膜等为固相载体，使金标识抗原或抗体与特异配体反应在膜上进行，建立了快速金标识免疫渗滤技术和金标识免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、本身免疫病免疫学检测中广泛应用。临床免疫学检验第3页金标识酶免分析技术原理：将滤金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径金溶胶颗粒（胶体金），标识金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫渗滤、免疫层析试验。金标识免疫层析是利用NC膜条状纤维毛细管作用，是样品在泳动中与金标识物及包被在NC膜上抗原或抗体结合，出现呈色阳性信号。临床免疫学检验第4页酶免疫技术酶和酶作用底物：1.辣根过氧化物酶（HRP）,惯用底物为邻苯二胺(OPD)，四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。2.碱性磷酸酶(AP)，多采取对硝基苯磷酸酯为底物。3.其它酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。临床免疫学检验第5页酶联免疫吸附试验★原理：酶联免疫吸附技术是免疫酶技术中固相酶免疫测定一个技术。基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面，再用酶标识抗原或抗体与已被固定对应抗体或抗原发生特异性反应，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度（A）值表示，所测A值与待测抗体或抗原水平呈相关关系。临床免疫学检验第6页酶联免疫吸附试验1.间接法：用于检测样本中特异性抗体将已知特异性抗原包被于聚苯乙烯板微孔，形成固相抗原；洗弃未结合抗原；加待检样本，若其中含有特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原-抗体复合物；洗弃未反应部分，加酶标识抗抗体（普通为标识抗人IgG或葡萄球菌A蛋白），使在固相载体上形成抗原-待检抗体-标识抗体复合物；洗弃未反应部分，加入酶底物及色原呈色，在一定波长下测吸光度（A）值判定待测抗体有没有和水平。临床免疫学检验第7页酶联免疫吸附试验2.竞争法：用于检测待检样本中未知抗原或抗体。测定抗原（抗体）时用已知抗体（抗原）包被固相载体，然后同时加入含有待测抗原（抗体）样本和酶标识抗原（抗体），使待测抗原（抗体）与酶标识抗原（抗体）竞争结合在固相载体上抗体（抗原）；洗板；加酶底物及色原呈色。待测溶液抗原（抗体）量越多，则被结合酶标识抗原（抗体）量越少，呈色越浅。呈色深浅与待测抗原（抗体）量成反比。临床免疫学检验第8页酶联免疫吸附试验3.双抗体或双抗原夹心法：双抗体夹心法：用于检测相对分子质量较大蛋白质抗原先将已知特异性抗体包被于固相载体上，加待测样本，若其中有对应抗标准与固相抗体特异性结合；洗板后加入酶标识特异性抗体，使在固相载体上形成包被抗体-待测抗原-酶标识抗体复合物；洗板；加酶底物及色原呈色。抗原或抗体水平与所测吸光度（A）值呈正相关。双抗原夹心法：用包被抗原和酶标识抗原检测样本中特异性抗体。临床免疫学检验第9页酶联免疫吸附试验4.捕捉法5.生物素与亲和素ELISA(ABC-ELISA)临床免疫学检验第10页酶联免疫吸附试验试剂组成1.标识用酶：最惯用辣根过氧化物酶（HRP）标识各种抗体、抗原或亲和素2.酶底物与色原：HRP底物是H2O2（或过氧化脲）；HRP可用色原很多，惯用为邻苯二胺（OPD），3，3，，5，5，-四甲基联苯硫酸盐（TMBS）等。临床免疫学检验第11页传染病免疫学检验1.甲型病毒性肝炎（HAV）2.乙型病毒性肝炎(HBV)3.丙型病毒性肝炎(HCV)4.抗人类免疫缺点病毒（HIV）5.梅毒血清学检测（TP）6.丁型肝炎(HDV)临床免疫学检验第12页甲型病毒性肝炎（HAV）HAV属小RNA病毒，为正单链RNA病毒。HAV主要经粪-口路径传输。潜伏期平均28天。HAV抵抗力较强，60℃加热10-12h后仍含有感染性，85℃加热马上灭活，对乙醚、氯仿及PH为3酸性环境有抵抗力。临床免疫学检验第13页甲型病毒性肝炎（HAV）诊疗甲型肝炎特异性血清学指标是抗HAVIgM类抗体和IgG类抗体。人感染HAV后，血液中首先出现抗HAV-IgM,与发病后2~3周达高峰，所以抗HAV-IgM是公认早期诊疗甲型肝炎指标。抗HAV-IgG普通在急性感染后6个月达高峰，然后逐步下降，但维持时间较长，可终生存在。所以抗HAV-IgG可作为人群HAV既往感染检测指标。临床免疫学检验第14页乙型病毒性肝炎生物学性状：HBV属于嗜肝DNA病毒科。为双链环状DNA。完整HBV病毒称为Dane颗粒，球形，有包膜(即HBSAg)。HBV有三种颗粒：大球形颗粒，含有感染性完整颗粒，又称Dane颗粒；小球形颗粒，无传染性；管形颗粒，不含病毒核酸由小球形颗粒串联而成。临床免疫学检验第15页乙型病毒性肝炎HBV抗原包含：①表面抗原（HBSAg），是HBV衣壳蛋白，是HBV感染主要标志，含有抗原性，可刺激机体产生抗HBS。抗HBS可中和HBV，是一个保护性抗体。②关键抗原（HBCAg），是病毒核衣壳成份，被HBSAg包被，所以在感染者血中不易检出。HBCAg可刺激机体产生抗HBC抗体。③e抗原（HBeAg），是HBV关键可溶性抗原，HBeAg阳性表示病毒在体内复制，传染性较强。HBeAg可刺激机体产生抗HBe抗体，此抗体对HBV感染含有保护作用。临床免疫学检验第16页乙型病毒性肝炎HBV对低温、干燥、紫外线、70%乙醇都有耐受性。煮沸100℃10min、高压蒸汽灭菌121℃15min或干热160℃2h均可灭活HBV。5~10g/L次氯酸钠30min，0.5%过氧乙酸15min均可破坏其传染性。急性和慢性乙型肝炎病人及血液HBSAg阳性无症状携带者是HBV主要传染源。可经血液、唾液、精液和阴道分泌物等传输。HBV主要经血液、血制品、性接触、日常生活接触和母婴垂直传输。临床免疫学检验第17页乙型病毒性肝炎当前检测HBV特意血清标志物主要有HBSAg、HBSAb、HBeAg、HBeAb、抗HBC-IgM和抗HBC-IgG，惯用检测方法为ELISA法，金标识免疫层析法和化学发光法。临床免疫学检验第18页乙型病毒性肝炎测定原理1.HBSAg测定原理：采取双抗体夹心法。将纯化抗HBS包被固相载体，加入待测样品，若其中含有HBSAg,则与载体上抗HBS结合，再加入HRP标识抗HBS抗体，加酶底物及色原呈色.呈色程度与HBSAg含量成正比。2.HBSAb测定原理：采取双抗原夹心法。3.HBeAg测定原理：双抗体夹心法4.HBeAb、HBCAb测定原理：竞争法临床免疫学检验第19页HBV血清学标志物临床意义感染模式HBSAgHBeAg抗HBC抗HBe抗HBS临床意义IgMIgG1+-----急性乙肝潜伏期后期、携带者2++----急性乙肝早期或潜伏期3+++---急性乙肝早期4+±++--急性乙肝后期5+±±---急性或慢性乙肝、有HBV复制6++±±+-急性或慢性乙肝、7+-±±+-急性期或无症状携带者、HBeAg阴性慢性乙肝8+---+-慢性乙肝，无或低度HBV复制、乙肝恢复期、9---+-+既往感染、隐匿性慢性乙肝10-----+接种过乙肝疫苗临床免疫学检验第20页丙型病毒性肝炎(HCV)HCV是单正链RNA病毒，呈球形颗粒状，主要在干细胞内进行复制。HCV对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感，煮沸、紫外线照射及甲醛处理均可使其灭活。HCV主要经血和血制品传输。急性和慢性丙型肝炎病人及HCV无症状携带者为HCV主要传染源。而ALT不正常者，为主要传染源。HCV感染特异性血清学标志是抗HCV抗体，惯用方法为ELISA,此为筛查方法。所测主要为抗HCV-IgG。重组免疫印迹试验（RIBA）为确诊试验。临床免疫学检验第21页丙型病毒性肝炎检测原理为间接ELISA法。包被抗原为HCV基因工程抗原和人工合成多肽抗原最正确百分比组合物（含HCV关键蛋白、NS3、NS4和NS5蛋白）。待测血清中如有抗HCV，将与包被抗原结合，待加入酶结合物（HRP-抗人IgG）和酶底物及色原溶液后即可产生呈色反应。临床免疫学检验第22页丙型病毒性肝炎(HCV)临床意义HCV是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎主要病原。HCV感染后可造成慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等各种肝脏疾病。抗HCV阳性而血清中没有HCVRNA提醒既往感染。临床免疫学检验第23页抗人类免疫缺点病毒（HIV）HIV属于逆转录病毒科慢病毒属，分两型，引发全球艾滋病流行为HIV-1型，流行局限于西部非洲艾滋病病原为HIV-2型。HIV主要结构蛋白基因最少有3个：gag基因，编码病毒衣壳蛋白p24;pol基因，编码逆转录酶(p66)与整合酶(p31);env基因，编码包膜糖蛋白前体gp160,在蛋白酶作用下gp160裂解成gp120和gp41。临床免疫学检验第24页艾滋病临床分期1.急性感染期2.无症状感染期(潜伏期)3.艾滋病相关综合征4.艾滋病临床免疫学检验第25页HIV传输路径1.血液传输2.性接触传输3.母婴垂直传输临床免疫学检验第26页HIV抵抗力HIV对酸性环境、消毒剂和去垢剂等敏感，病毒在PH2环境下失活，50%~70%乙醇、2%甲醛、5%石碳酸、0.1%戊二醛、5g/L次氯酸钠等均可灭活HIV。但该病毒对碱性环境（PH9.0左右），紫外线较为耐受。临床免疫学检验第27页抗人类免疫缺点病毒（HIV）HIV试验室分为初筛试验室和确认试验室。HIV初筛方法惯用：ELISA、免疫荧光法、胶乳颗粒凝集法、金标识免疫渗滤法等HIV确认试验：免疫印迹法（WB）临床免疫学检验第28页ELISA法检测HIV抗体原理：采取间接ELISA或双抗原夹心ELISA法。用基因工程或人工合成HIV-1和HIV-2多肽抗原合理地组合包被反应板微孔，若待测血清中存在HIV抗体时，则与固相抗原结合，洗去未反应物，再加酶标识抗人IgG（双抗原夹心法采取是酶标识HIV多肽抗原组合）是酶底物及色原显色。呈色程度与待测HIV抗体水平成正比。临床免疫学检验第29页ELISA法检测HIV抗体试剂：筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册同意、批检合格，临床评定质量优良，在使用期内试剂。结果判定：按试剂盒内临界值计算公式计算，高于临界值为阳性。初筛阳性反应标本需用原有试剂加上另外一个不一样原理不一样厂家试剂复测。如两种试剂均为阴性，则汇报HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认试验室确认。再经确认试验室确认前，初筛试验室不得公布HIV阳性汇报。可出具“HIV抗体待复检”汇报。临床免疫学检验第30页ELISA法检测HIV抗体临床意义HIV抗体阳性提醒以下：1.感染了HIV，可作为传染源将HIV传输他人。2.抗HIV阳性者（除外18个月婴儿），5年之内将有10%~30%人发展为艾滋病。3.对HIV抗体阳性母亲所生婴儿，如18个月内检测HIV抗体阳性，不能诊疗为HIV抗体感染，尚需用HIV核酸检测或18个月后血清抗体检测来判断。HIV抗体不确定提醒：提议病人在汇报后3个月后重新复查，如复查阴性，则未被感染。如复查阳性可判断感染HIV。临床免疫学检验第31页免疫印迹法测定HIV抗体结果判定：HIV抗体阳性有以下任何一项阳性即可确认：1.最少有两条env带（gp41、gp160和gp120）出现。2.最少有一条env带和p24同时出现。HIV抗体阴性：无HIV抗体特异带出现HIV抗体不确定：出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。临床免疫学检验第32页免疫印迹法测定HIV抗体抗原检测：P24抗原抗体检测：P24和P55抗体出现最早，随即出现gp120和gp160抗体。这些被认为是早期感染最稳定指标。临床免疫学检验第33页梅毒梅毒属于一个性传输疾病，病原体为梅毒螺旋体。梅毒螺旋体为密螺旋体，在体外不易生存，煮沸、干燥、惯用消毒剂均可致其死亡，但对潮湿、严寒环境耐受力较强。对青霉素、四环素、红霉素、庆大霉素均敏感。临床免疫学检验第34页梅毒传输路径梅毒螺旋体主要经过性接触传染，接吻、手术、哺乳、输血、接触污染物也可被传染。患梅毒孕妇可经过胎盘感染胎儿，早期可致胎儿流产、早产，晚期感染成活胎儿可患先天梅毒。临床免疫学检验第35页梅毒临床分期第一期：硬兴下疳，极易传输感染。第二期：梅毒疹期，全身皮肤粘膜出现皮疹。第一、二期称早期梅毒，传染性强、破坏性较小。第三期：梅毒，即梅毒晚期。病损部位螺旋体少但破坏性大。临床免疫学检验第36页梅毒血清学试验1.非特异性类脂质抗原试验：试验使用抗原从牛心中提取心磷脂、胆固醇和纯化磷脂酰胆碱（卵磷脂）组成，即类脂质抗原，测定患者血清中反应素(即抗脂质抗体)。用于梅毒筛查。方法主要有：性病研究试验室试验（VDRL）快速血浆反应素试验(RPR):半定量评价疗效和判断有没有再感染。不加热血清反应素试验(USR)甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)临床免疫学检验第37页梅毒血清学试验2.梅毒螺旋体抗原试验：使用抗原是梅毒螺旋体特异成份。这类试验有各种，如梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)临床免疫学检验第38页甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)原理：试剂中心磷脂作为抗原与抗体发生反应，卵磷脂可加强心磷脂抗原性，胆固醇可增强抗体敏感性。这些成份溶于无水乙醇中，再加入水后胆固醇析出形成载体