2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体-高二生物完整版选课件（人教版2019选择性必修3）

教学目标：1、阐明动物细胞培养的条件和过程。2、简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。3、阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程，认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。4、阐明利用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和该技术的应用前景。教学重点：1、动物细胞培养的条件和过程。

2、干细胞在生物医学工程中的应用。3、单克隆抗体的应用和制备。4、用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程教学难点：单克隆抗体的制备过程；用动物细胞体细胞核移植技术克隆动物的过程。第2章细胞工程第2节动物细胞工程运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？1970年人-鼠细胞融合融合实验灭活的仙台病毒诱导2、结果：二、动物细胞融合技术与单克隆抗体1、概念：（一）动物细胞融合技术动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。诱导融合杂交细胞杂交细胞具有原两个或多个细胞的遗传信息。3、原理：细胞膜的流动性4、融合完成的标志：细胞核融合，形成单核细胞物理方法：电融合法等诱导融合杂交细胞化学方法：PEG融合法生物方法：灭活病毒诱导法与植物原生质体融合的诱导方法相同5、诱融方法：生物方法：灭活病毒诱导法灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。物理方法：电融合法等诱导融合杂交细胞化学方法：PEG融合法生物方法：灭活病毒诱导法与植物原生质体融合的诱导方法相同思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。5、诱融方法：6、意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜的流动性植物细胞的全能性细胞膜的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能7、应用：（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。诱导融合杂交细胞什么是抗体？怎么产生的？主要分布在哪？概念：

抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。产生：B细胞受抗原刺激后，增殖分化为浆细胞，浆细胞合成并分泌抗体。分布：主要分布于血清中,也分布于组织液及外分泌液中（二）单克隆抗体及其应用1、传统抗体制备的方法产量低纯度低特异性差缺点：反复注射抗原动物产生抗体从动物的血清中分离抗体如何获得大量的单一抗体呢？每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体单一B淋巴细胞细胞群选择克隆产生大量纯度高特异性强的抗体注意：在体外培养条件下一个B淋巴细胞不可能无限增殖有能无限增殖的细胞吗？利用产生特异性抗体的B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。2、单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒的设想：B淋巴细胞骨髓瘤细胞（能产生抗体）（能大量增殖）融合细胞（既能产生抗体，又能大量增殖）米尔斯坦科勒

由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖单克隆抗体制备过程是怎样的？B淋巴细胞多种骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合能产生抗体，但不能大量增殖不能产生抗体，但能大量增殖PEG融合法、电融合法、灭活病毒注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞从脾中提取目的：获得产生相应抗体的B细胞诱导融合之后，一定会得到杂交瘤细胞吗？多种杂交细胞：未融合的细胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次筛选：用特定的选择培养基在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长杂交瘤细胞：（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）第二次筛选：克隆化培养、抗体检测（可进行多次）抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞克隆化培养多孔细胞培养板（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）注射到小鼠腹腔内体外培养单克隆抗体从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）特定抗原多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合多种融合细胞选择培养基进行筛选杂交瘤细胞抗体检测分泌所需抗体的杂交瘤细胞体外培养注射小鼠腹腔内增殖克隆化培养多次筛选单克隆抗体获取注射小鼠培养骨髓瘤细胞未融合细胞(第一次筛选)(第二次筛选)3、制备过程：注：1、该过程中应用到的技术：2、注射特定抗原的目的：3、第一次筛选的原因：

目的：

方法：原理：4、杂交瘤细胞的特点：动物细胞融合、动物细胞培养用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长既能迅速大量增殖，又能产生抗体有B、瘤、B-B、瘤-瘤、B-瘤细胞5、第二次筛选的目的：方法：选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即6、抗体检测原理：7、如何获取大量所需杂交瘤细胞：8、如何获取单克隆抗体①体外培养：②小鼠腹腔内培养：获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合阳抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取思考·讨论资料1:用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”在妊娠第8天就可以做出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。资料2:使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。ADC示意图问题：细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害。解决方法：抗体-药物偶联物(ADC)，将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。抗体药物接头思考·讨论ADC的作用机制示意图①ADC②③④溶酶体裂解释放药物⑤细胞凋亡思考·讨论讨论：1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原,将连接的药物输送到靶细胞。药物发挥治疗效应。如杀伤靶细胞。思考·讨论2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床上各具有什么优势？单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应,因此检测的特异性和灵敏度大大提高;生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用,有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用,因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。思考·讨论4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗,如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面,单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例,用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体,可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。思考·讨论①作为诊断试剂②运载药物③作为药物治疗疾病诊断疾病治疗疾病4、单克隆抗体优点：准确识别抗原的细微差异、与特定抗原发生特异性结合、可大量制备5、应用：①作为诊断试剂应用利用放射性同位素或荧光标记的单克隆杭体，在特定的组织中成像的枝术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。病毒蛋白的检测依赖抗体(如图)优点：可以省去提取病毒核酸的繁琐步骤，直接用发病期患者的血清或痰液进行蛋白免疫分析，在短时间内就可得到结果。缺点：相比核酸检测，蛋白检测具有滞后性，不能及时检测出是否感染病毒。②运载药物应用ADC=单克隆抗体+接头+药物抗体-药物偶联物（ADC）由单克隆抗体、连接子和小分子细胞毒药物偶联而成，可以像精准制导的导弹一样对癌细胞实施精准打击。瞄准装置爆炸装置脂质体给药高效

低毒

靶向抗肿瘤药物载体：阿霉素脂质体和顺铂脂质体已在国外上市。②运载药物应用应用③治疗疾病单克隆抗体不仅可以运载药物，而且自身也能用于治疗疾病。单克隆抗体药物占有非常重要的地位。排名药物中文名销售额(亿美元)适应症类型1Humria修美乐199.36自身免疫疾病单抗6Herceptin赫赛汀70.32乳腺癌等多种癌症单抗7Avastin安维汀68.98结肠癌等多中癌症单抗8Rituxan美罗华68.01白血病单抗9Opdivo纳武单抗67.35多种肿瘤单抗2018年全球药物销售额排名前10的单抗药物修美乐已连续8年蝉联榜首。2021年新冠疫苗(mRNA疫苗)位居榜首，修美乐位居第二位。修美乐(即阿达木单抗)是全人源化单克隆抗体的一种，也是一种可自我注射的生物治疗药物，是全球首个被批准的肿瘤坏死因子全人源单克隆抗体。阿达木单抗在全球有10个适应证获批，在中国它先后在国家食品药品监督管理总局获批了2个适应证，分别是类风湿关节炎和强直性脊柱炎。例：多年位居全球药物销售榜首的单抗——修美乐PD-1及其配体（PD-L1）抑制剂是免疫哨点单抗药物，其应答之广度、深度、和持久性均十分罕见，是近年来肿瘤免疫疗法研究的热点。已上市的尼伏单抗、潘利珠单抗和替雷利珠单抗属于PD-1抑制剂，主要用于黑素瘤和非小细胞肺癌的治疗，对肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等的疗效还在大规模临床试验中。PD-L1抑制剂阿替珠单抗、度伐单抗和阿维单抗已被批准用于治疗尿道上皮癌。例：癌症的免疫治疗中国首个自主知识产权抗新冠特效药：安巴韦单抗和罗米司韦单抗获批。例：我国自主研制的抗新冠特效药2021年，由清华大学医学院教授、清华大学全球健康与传染病研究中心与艾滋病综合研究中