分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数实验的改进

分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数实验的改进

物理和化学实验是学生为独立的基础实验课程而完成的一门独立的基础课程。其中，“分光光度法测定葡萄糖酶常数”实验是物理和化学史研究中确定学生综合技能的重要内容。由于酶活性和氧化性能对温度、ph和其他因素都有很大的影响，因此学生在实验过程中通常很难获得理想的结果。根据之前的实验工作，本文对教材的操作步骤进行了一些改进，并详细考察了不同温度和ph的条件对甘蔗酶水解反应率的影响。1蔗糖酶活性的测定本实验用的蔗糖酶是一种水解酶,它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖.葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定浓度范围内,葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系,因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量,随即可以根据葡萄糖浓度的增加来计算出蔗糖酶的水解反应速率.测量不同底物(蔗糖)浓度的相应反应速率,就可用作图法计算出米氏常数值Km.2对教材方法的改良针对学生在该实验操作、处理过程中遇到的各种实际问题以及酶催化反应的基本特点,在马中良等人对相关实验改进的基础上,在实际教学中对教材方法做了如下改良.2.1蔗糖酶的制备方法目前从提取酵母中提取纯化蔗糖酶的研究较多,通常采用以下几种方法:甲苯自溶法、传统甲苯提取法、冻融法以及SDS抽提法等,这几种方法各有利弊.教材中该实验的蔗糖酶的制备采用甲苯提取法,具体操作为:在50mL的锥形瓶中加入鲜酵母10g,加入0.8g醋酸钠,搅拌15~20min后使块团溶化,加入1.5mL甲苯,用软木塞将瓶口塞住,摇动10min,放入37℃的恒温箱中保温60h.该方法采用鲜酵母搅拌时间长,较难溶化,同时用甲苯作提取剂,作为本科生基本实验,较大量地使用甲苯有一定的毒性且不利于废液处理.因此制备蔗糖酶改进如下:称取10g即发干酵母配成10%的溶液,搅拌20min后,放入37℃恒温箱中保温60h.小心吸取上层液体离心,离心后获得的清液,测试其活力单位为6.82U/mL.改进的方法提取蔗糖酶具有以下优点:在整个酶的制备过程中避免使用甲苯等有机溶剂;实验操作步骤较简便可行;提取酵母液活性较高;同时酶液的颜色无色透明.2.2水资源的加入可节约三叶片酸增加反应体系的效率教材中在比色测定时,用的是3mL二硝基水杨酸,在改进实验中只用1mL二硝基水杨酸进行比色反应.由于加入二硝基水杨酸量减少,反应体系显色相对也浅了,从而不需要再做任何稀释处理即可做比色测试,这样也去除了学生由于对反应体系进行稀释而造成的误差.通过以上改进可以节省约70%的水杨酸,同时也不需要稀释用的玻璃试管,虽然只是一小点改进,但对于几十个学生同时进行该实验来说,其减少的玻璃仪器等耗材以及节约的化学试剂也不可小觑.2.3在水浸浴和适用naoh溶液时总结合反应时,为什么要在其土壤中终止酶教材中采用5mLNaOH溶液(0.1mol/L)来终止酶反应,改进后直接将反应结束的试管迅速置于沸水浴中作用5min,来代替用NaOH溶液终止酶反应,因为酶在沸水浴中很快就会失活.如果用5mLNaOH溶液(0.1mol/L)终止酶反应,由于前面的反应的体积已经为6mL,再加入5mLNaOH溶液终止反应,这时总体积已达到11mL,而常用试管一般为15mL,试管中溶液太多不能马上与反应溶液混匀,致使NaOH溶液的加入与之前溶液混合较慢而不能马上终止反应,而用沸水浴方法终止酶反应,可以准确确定时间并迅速终止反应,同时也节约了试剂.学生按照对这些改进后的实验步骤进行操作,取得了很好的效果.3影响甘蔗酶反应率的讨论参照上述改进的实验方案,考察了不同温度和pH条件下对蔗糖酶水解反应速率的影响.3.1ph对蔗糖酶催化反应的影响称取等量酶分别在室温25,30,40,50,60,70,80,90℃8组不同温度下,测定其转化糖量.实验采用优尼科7200分光光度计在540nm的波长下,逐一进行比色测定光密度值.在同一温度下,分别测试3次.表1是在不同温度下蔗糖酶光密度值的测定结果,同时绘制了温度与蔗糖水解生成葡萄糖量(用M表示)的工作曲线(如图1所示),结果表明,在50℃时,测得的光密度值最大,可知在此温度下,蔗糖酶水解速率最大.根据上述实验结果,实验选取在50℃时,考察不同pH条件下蔗糖酶催化蔗糖分解速率.以Na2HPO4—柠檬酸为缓冲溶液调整反应体系的pH,分别在pH为2.0,3.0,4.0,4.4,4.6,5.0,5.2,5.4,6.0,7.0的条件下,测试在等量酶下以同浓度的蔗糖为反应底物进行催化反应的结果.根据上述各反应液测得的光密度值,在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖浓度,得到水解生成葡萄糖的质量(用M表示),绘制出不同pH与水解生成葡萄糖质量的工作曲线(如图2所示).从图2可以看出,在pH为4.4—5.2时,蔗糖酶的反应活性较高,在pH为5.2时达到最高值,但pH达到中性以后,其反应活性明显降低.本文基于酶学实验的基本特性以及总结多年来学生在实验过程中遇到的问题,在前人工作的基础上,对“分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数”这一实验在蔗糖酶制备方法、比色测定、酶终止反应等方面进行了一定的改进.同时由于酶的活性以及催化性能受温度、酸度等因素影响较大,综合考察了不同温度以及不同pH对