folin-ulecileu法测定西兰花中总酚的工艺研究

folin-ulecileu法测定西兰花中总酚的工艺研究

兰花是一门十字花科，是甘草的另一个变种。西兰花中的营养成分,不仅含量高,而且十分全面,主要包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素C和胡萝卜素等。西兰花不仅是营养丰富的蔬菜,而且是一种保健蔬菜。国外报道西兰花的平均营养价值及防病作用远远超过其他蔬菜,名列第一。近年来,我国对西兰花的研究主要集中在西兰花的抗肿瘤、抗癌防诱变作用方面,而有关西兰花多酚的提取及其抗氧化活性未见报道。西兰花中的酚类物质主要包括原花青素、酚酸及黄酮类物质,具有多种生物活性及很强、的抗氧化活性。以西兰花为原料,在不同条件下提取西兰花中多酚。通过单因素试验,研究不同乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对西兰花多酚得率的影响,并通过正交设计获得最佳的提取条件。同时对西兰花多酚的抗氧化性进行研究,为西兰花的进一步开发提供科学依据。1材料和方法1.1基2,2-diphenyl-1-picryl西兰花,购于青岛市城阳大润发;福林酚,北京索莱宝科技有限公司;2,2-二苯代苦味酰基自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl;DPPH),美国SIGMA公司;DTT(二硫苏糖醇),Solarbio;Tris,Sigma进口分装;邻苯三酚(焦性没食子酸),贵州遵义佳宏化工;无水乙醇、浓盐酸等均为分析纯,天津广成化学试剂公司。1.2实验仪器与仪器移液枪,德国GILSON;DU-800紫分光光度计,美国贝克曼公司;FD-ID-80冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;SHA-B型恒温振荡器,常州国华电器有限公司;AR1140型电子分析天平,奥豪斯国际贸易(上海)有限公司;一列二孔电热恒温水浴锅,龙口市先科仪器公司;迷你磁力振荡器,广州仪科实验室技术有限公司;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵,上海亚荣生化仪器厂;RE-52AA型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂。1.3测试方法1.3.1材料预处理1.3.2紫外分光光度法采用FolinCiocalteus法,利用紫外可见分光光度计在760nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,质量浓度(mg/mL)为横坐标,绘制没食子酸标准曲线。1.3.3从兰花中提取总酚1.3.4从兰花提取的单酚单因素试验1.3.4.料液比的确定称取新鲜西兰花3g,浸提试剂的乙醇体积分数分别选取30%、40%、50%、60%、70%5个水平,料液比(西兰花质量/乙醇体积)为1∶10,提取温度40℃,浸提30min。按照1.3.3节中的工艺对西兰花中的多酚进行提取、测定,每个样品平行测定3次,考察浸提试剂乙醇的体积分数对西兰花多酚提取率的影响。1.3.4.提取温度和时间称取新鲜西兰花3g,浸提试剂为30%乙醇水溶液,料液比分别选取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶255个水平,提取温度40℃,浸提30min。按照1.3.3节中的工艺对西兰花中的多酚进行提取、测定,每个样品平行测定3次,考察料液比对西兰花多酚提取率的影响。1.3.4.提取温度的确定称取新鲜西兰花3g,浸提试剂为30%乙醇水溶液,料液比(西兰花质量/乙醇体积)为1∶10,提取温度选取30、40、50、60、70℃5个水平,浸提30min。按照1.3.3节中的工艺对西兰花中的多酚进行提取、测定,每个样品平行测定3次,考察提取温度对西兰花多酚提取率的影响。1.3.4.浸提液制备称取新鲜西兰花3g,浸提试剂为30%乙醇水溶液,料液比(西兰花质量/乙醇体积)为1∶10,提取温度40℃,浸提选取30、40、50、60、70min5个水平。1.3.5提取率的测定按照上述单因素试验的提取方法,经过多次单因子对比试验,在单因素试验结果基础上选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素,每因素3水平,以西兰花中总酚的提取率为考察指标,使用L9(34)正交表安排试验。1.3.6西林多酚的抗逆性1.3.6.清除剂dpph自由基清除率的测定DPPH法是一种快速、简便、灵敏、直接、可行的方法。其中,DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种很稳定的自由基,在乙醇溶液中呈深紫色,在517nm处有最大吸收峰,当有自由基清除剂(AE)存在时,其单电子被结合而使其颜色减褪,在最大吸收波长处的吸光度减小,减小的程度与清除剂的清除能力及其数量呈定量关系。按照西兰花多酚的最优提取工艺对西兰花多酚进行提取,并提取液旋转蒸发浓缩。分别取25、50、75、100、125、150μg/mL西兰花多酚提取液,测定其对DPPH自由基的清除率。测定时以VC做阳性对照,每个样品进行3次平行试验。以IC50值作为评价试样清除DPPH自由基能力的指标。DPPH清除率按如下公式计算:DPPH清除率(%)=[1-(A样品-A样参比)/A对照]×100%1.3.6.清除超氧阴离子选取25、50、75、100、125μg/mL西兰花多酚提取液,按照表3方法测定其对超氧阴离子的清除率。测定时以1mg/mL的VC标准品做阳性对照,每个样品进行3次平行试验。超氧阴离子清除率按如下公式计算:超氧阴离子自由基清除率(%)=2结果与分析2.1非酸酸标准曲线2.2采用单因素萃取法分析了核电站二酚的单环芳烃提取结果2.2.1有机溶剂提取由图2可知,随浸提试剂的乙醇体积分数的升高,西兰花多酚的提取率先增加后减少。这可能是当乙醇体积分数在30%~50%范围内时,有利于破坏酚类物质与蛋白质、多糖等物质之间的氢键和疏水相互作用力,使得西兰花中的酚类被提取出来,因此有机溶剂在一定的范围内有助于原料中多酚的提取;但是当乙醇体积分数继续增大时,可能是由于有机溶剂与西兰花中酚类物质极性差异增大,从而致使总酚提取率降低。可见在乙醇体积分数为50%时,西兰花中的酚类物质可以达到最大的溶出,因此乙醇体积分数在50%时西兰花中的酚类的提取率最大。2.2.2料/液比对织物多酚提取率的影响由图3可知,随着浸提试剂用量逐渐增加,西兰花多酚的提取率先增后减。当料/液比为1∶20时,西兰花多酚的提取率最高。继续增大料液比,并不能显著增加西兰花中总酚的提取率,所以从浸提效果,减少溶剂用量和降低浓缩负荷等方面综合考虑,确定料液比在1∶20时为最佳的提取条件。2.2.3温度对总酚提取的影响由图4可知,西兰花多酚的提取率随着提取温度的升高呈先增后减的趋势。究其原因可能是多酚通常存在于植物细胞中,升高温度可以软化组织,促进细胞壁破裂,加快分子运动速度,有利于细胞内多酚类物质的溶出。同时由于温度升高提取液黏度降低,扩散系数增加,促使提取速度加快。当提取温度继续上升时,其萃取量减少,可能是高温造成酚类物质的氧化而损失,从而造成总酚的提取率减少。因此西兰花多酚的最佳提取温度是50℃。2.2.4提取时间对提取率的影响由图5可知,西兰花多酚的提取率随着提取时间的增加先明显增大,当超过60min时,其提取率变化不再明显。从理论上看,提取时间越长对酚类的提取就越充分,但是在实际的生产过程中,延长提取时间,就意味着延长生产周期,增加了能量消耗,提高了生产成本。因此,西兰花多酚的最佳提取时间为60min。2.3最佳提取剂的确定由表3中的极差值结果看出:影响西兰花中总酚含量的提取率的因素主次顺序为:B>D>C>A,即料液比>提取时间>提取温度>乙醇体积分数(%)。由k值分析可知,西兰花多酚提取的最佳组合为A3B3C3D1,即:乙醇体积百分数为60%,料液比1∶25,提取温度60℃,提取时间40min,由于正交表中最佳组合为A3B3C2D1,因此进行验证试验。验证试验:按上述最佳条件,从新鲜的西兰花中提取的总酚含量,3次测定的吸光值的均值为0.4286,西兰花多酚的提取率为1.268mg/g,明显高于其他组合。2.4西林多酚的抗逆性2.4.1ph自由基清除率测定由试验可知:阳性对照VC对DPPH清除率为88.89%。西兰花多酚质量浓度大于125μg/mL时,其对DPPH自由基的清除率随西兰花多酚质量浓度增加而增加,增长趋势缓慢,不再随线性变化,其最大清除率可达到81.93%。从图6可看出,西兰花多酚对DPPH清除率在19.34%~73.46%范围内线性显著,线性方程为y=0.0058x+0.0438。因此,可以得出西兰花多酚对DPPH自由基的半数抑制剂量IC50为78.66μg/mL。2.4.2小鼠超氧阴离子自由基清除率由试验可知:阳性对照VC对超氧阴离子(O2-)的清除率为94.22%。由图7可知,西兰花多酚提取液对超氧阴离子(O2-)的清除作用明显。西兰花多酚浓缩液的O2-自由基的清除率可达到70.18%。由线性方程可得到西兰花多酚对超氧阴离子(O2-)自由基的半数抑制剂量IC50为76.33μg/mL。3抗氧化活性的测定本试验通过对西兰花多酚的提取工艺进行优化,得出西兰花中多酚的最佳提取条件为:乙醇体积分数为60%,料液比1∶25,提取温度60℃,提取时间40min。在最优提取条件下,西兰花多酚提取率为1.268mg/g。然后对最优条件下提取的西兰花多酚进行抗氧化试验。结果显示:西兰花多酚的质量浓度和DPPH自由基的清除率在一定范围内呈线性相关,它对DPPH自由基的最大清除率可达到81.93%,其对DPPH的半数抑制剂量IC50为78.66μg/mL;西兰花多酚浓缩液对O2-自由基的清除率可达到70.18%,其对超氧阴离子(O2-)自由基的半数抑制剂量IC50为76.33μg/mL。因此,西兰花多酚具有较好的抗氧化效果。取新鲜西兰花可食花头部分,试验前用料理机打碎。称取西兰花3g,浸