10基因治疗原理与研究进展

第十三章

基因治疗原理与争论进展

11/3/20231基因治疗的概念将某个遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以到达治疗疾病目的的方法。11/3/20232基因治疗分类体细胞(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的转变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进展矫正当代及子代11/3/20233

内容提要第一节基因治疗的策略其次节基因转移技术第三节基因干预第四节治疗基因的受控表达第五节基因治疗的应用争论第六节基因治疗的问题与展望11/3/20234

第一节基因治疗的策略一、基因置换二、基因添加三、基因干预四、自杀基因治疗五、基因免疫治疗11/3/20235一、基因置换〔genereplacement〕

定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的特殊序列进展校正。特点：对缺陷基因的缺陷部位进展准确的原位修复，不涉及基因组的任何转变。11/3/20236定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有一样的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进展局部基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术又称为基因打靶(genetargeting〕基因同源重组技术11/3/20237基因同源重组技术重组载体染色体校正后的染色体11/3/20238二、基因添加

(geneaugmentation)定义：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型：在基因缺陷的细胞中导入相应的正常基因，补偿缺陷基因的功能，细胞内的缺陷基因并未除去；向靶细胞中导入其原来不表达的基因，利用其表达产物到达治疗疾病的目的。11/3/20239定义：承受特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的构造而使之不能表达，以到达治疗疾病的目的。例如反义核酸、核酶或干扰RNA技术等。三、基因干预〔geneinterference〕11/3/202310

原理：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而到达去除肿瘤细胞的目的。为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。四、自杀基因治疗11/3/202311

自杀基因的作用机制11/3/202312TK/GCV：单纯疱疹病毒〔herpssimplexvirus,HSV〕Ⅰ型胸苷激酶〔thymidinekinase,tk〕基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷〔ganciclovir,GCV〕转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。〔一〕自杀基因系统CD/5-FC：大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶〔cytosinedeaminase,CD〕基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶〔5-FC〕转变成毒性产物5-氟尿嘧啶〔5-FU〕。11/3/202313旁观者效应(bystandereffect)：“自杀基因”导入后，不仅使导入了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻或远处的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。明显增加了自杀基因的肿瘤杀伤作用。〔二〕旁观者效应11/3/202314五、基因免疫治疗通过将抗癌免疫增加的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增加肿瘤微环境中的抗癌免疫反响。11/3/202315其次节基因转移技术一、病毒介导的基因转移系统二、非病毒介导的基因转移系统11/3/2023161.exvivo〔经活体〕是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以到达治疗的目的。2.invivo〔活体内〕是指将目的基因直接应用于患者体内。依据基因转移的途径不同，基因治疗分为：11/3/202317基因转移的两种途径载体目的基因invivoexvivo靶细胞将目的基因直接输入体内将目的基因导入患者靶细胞,体外培育将重组靶细胞回输体内11/3/202318

一、病毒介导的基因转移系统病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床试验预备和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。11/3/202319〔一〕逆转录病毒〔Retrovirus〕载体+ssRNA逆转录酶核心蛋白膜蛋白人类免疫缺陷病毒〔HIV〕11/3/202320逆转录病毒的生活周期11/3/202321两端各有一长末端重复序列LTR。LTR由U3、R和U5三局部组成，内含增加子、启动子、poly(A)加尾信号及病毒整合序列(IS)。病毒有三个构造基因：gag、pol和env基因〔编码包装蛋白〕。5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列〔ψ〕等。1.逆转录病毒前病毒的构造特点11/3/2023222.逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒载体保存病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖力气的病毒颗粒。LTRtherapeuticgeneLTR11/3/2023232.逆转录病毒介导的基因转移系统帮助细胞株它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建而成。该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转录病毒载体包装。由于缺乏包装型号，本身不能被包装成病毒颗粒。gagpolenv11/3/202324逆转录病毒包装系统11/3/202325逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒构造基因缺失，但不影响其他局部的活性。前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。包装好的假病毒颗粒易于分别制备。3.逆转录病毒载体的特点11/3/202326

4.

逆转录病毒载体的主要缺点

随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危急；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。11/3/202327〔二〕腺病毒(adenovirus，AV)载体11/3/202328腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

11/3/2023291.腺病毒载体的优点基因导入效率高；宿主范围广；基因转导与细胞分裂无关；重组腺病毒可通过口服经肠道吸取、或喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因。11/3/2023302.腺病毒载体缺点不能整合到靶细胞的基因组DNA中。治疗基因表达时间相对较短。宿主的免疫反响导致腺病毒载体表达短暂。局部环节可能产生复制型腺病毒。靶向性差。11/3/202331〔三〕腺相关病毒〔adeno-associatedvirus,AAV〕载体AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜。AAV不能独立复制，只有在帮助病毒存在时，才能进展复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。11/3/202332腺相关病毒基因组的构造Ψ：包装信号序列；REP:病毒复制基因；CAP:编码衣壳蛋白的基因；ITR：反向末端重复序列11/3/2023331.AAV的特点以潜伏感染为主；高效定点整合至人染色体中，避开随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危急性。11/3/2023342.AAV载体的缺陷：AAV载体容量小，最多只能容纳5kb外源DNA片段。感染效率比逆转录病毒载体低。在40%～80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。11/3/202335二、非病毒载体介导的基因转移系统

〔一〕脂质体介导的基因转移技术根本原理：利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA〔即目的基因〕转移至细胞内，并进展表达。11/3/202336脂质体介导的基因转移示意图11/3/202337〔二〕受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。11/3/202338受体介导转移技术示意图11/3/202339〔三〕基因直接注射技术

如：肌内注射携带凝血因子Ⅸ基因的重组AAV注射液，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ。11/3/202340第三节基因干预一、反义RNA二、RNA干扰三、核酶11/3/202341一、反义RNA〔一〕反义RNA与基因表达调控指能与特定基因mRNA互补结合的一类RNA,可抑制一些有害基因的翻译。关键技术问题：1.专一性转移问题2.反义RNA进入靶细胞前的降解问题11/3/202342〔二〕受体介导反义RNA转移技术受体介导反义RNA转移技术可以实现:受体介导的RNA转移特殊专一，而且效率高；被转移的RNA是被疼惜的，与四周环境之间存在多聚赖氨酸的疼惜层,可以反抗环境中的核酸酶的降解作用。11/3/202343〔三〕反义RNA的应用前景〔1〕安全性高〔2〕反义RNA设计和制备便利

〔3〕具有剂量调整效应

〔4〕能直接作用于一些RNA病毒11/3/202344二、RNA干扰

〔RNAinterference，RNAi〕由双链RNA诱发的基因沉默现象：与其有同源序列的mRNA被降解，从而抑制了该基因的表达。11/3/202345〔一〕RNA干扰的机制11/3/202346〔二〕RNA干扰的应用前景

1.争论基因功能的新工具

2.肿瘤的基因治疗

3.病毒性疾病的基因治疗11/3/202347三、核酶(ribozyme)

具有酶活性的RNA，可降解特异的mRNA序列。核酶靶RNA11/3/202348核酶的作用机制11/3/202349〔一〕核酶的设计用于基因治疗的核酶分子由三个局部组成，中间是保守序列〔能够组成酶活性构造域〕，两端是引导序列〔guidesequences〕。引导序列11/3/202350〔二〕核酶的应用与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间构造，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。11/3/202351

第四节治疗基因的受控表达

治疗基因的受控表达包括把握治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。其策略包括：基因内部调整机制、基因外部调整机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达及治疗基因的诱导表达等。11/3/202352利用特定基因的转录调控元件来把握治疗基因表达的细胞或组织特异性。一、基因内部的调整机制使用正常细胞的组织特异性启动子、增加子元件，例如酪氨酸酶基因的利用。使用病变细胞的组织特异性启动子、增加子元件，例如甲胎蛋白(AFP)基因的利用。11/3/202353二、基因外部的调整机制通过施加外部刺激，比方对病灶局部进展热处理或电离辐射等，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。11/3/202354三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达

利用病灶特异的微环境及其特异表达的基因来把握治疗基因的表达。如肿瘤组织往往会消逝葡萄糖缺乏或缺氧等微环境，其中高表达的GRP78/Bip蛋白编码基因的启动子即可用于把握治疗基因的肿瘤组织的特异表达。11/3/202355四、治疗基因的诱导表达可诱导性基因表达系统能防止治疗基因表达不再受外界把握。这种系统的必要成分：一种是转录激活物，它与DNA结合的活性受某种诱导药物把握；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活物有所响应。11/3/202356四环素抗性操纵子系统四环素操纵子中的抗性基因的转录受阻遏蛋白的负调控，而阻遏蛋白的活性又受到四环素药物的调控，其在四环素存在时会优先结合药物而无法与转录调控元件结合，即不能发挥阻遏转录的作用。。

〔一〕四环素操纵子中的转录负调控11/3/202357〔二〕四环素操纵子在治疗基因诱导表达系统中的应用Tet-Off系统：转录激活物保存了原阻遏蛋白的四环素结合特性，即与四环素结合时将不能与对应的表达调控元件结合，而无法发挥转录激活作用。Tet-On系统：转录激活物改造了原阻遏蛋白的四环素结合特性，即与四环素结合时才能与对应的表达调控元件结合，而发挥转录激活作用。11/3/20235811/3/202359第五节基因治疗的应用争论一、遗传病的基因治疗争论

1．腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症2．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病3．血友病和其他血浆蛋白缺乏症4．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病5．莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征6．家族性高胆固醇血症7．囊性纤维化病

11/3/202360二、恶性肿瘤基因治疗争论

常用基因治疗策略：基因增补基因干预技术自杀基因治疗—分子化疗肿瘤的免疫基因治疗提高化疗效果的帮助基因治疗〔药物增敏基因治疗；耐药基因治疗〕11/3/202361第一例基因治