药用蜂蜜真伪检测方法的建立

药用蜂蜜真伪检测方法的建立

蜂蜜是中国蜜蜂科昆虫。意大利蜜蜂apiscenatafabicis或melifismelifialinaeus所生产的蜂蜜。其主要成分为葡萄糖(25.2%~35.3%)和果糖(33.3%~43.0%)、多种氨基酸、矿物质、维生素和多种活性酶。蜂蜜以其丰富的营养和良好的保健功能而成为应用广泛的保健食品。蜂蜜还是中药药品生产中的重要的原辅料。如中药蜜丸、煎膏剂中蜂蜜的用量占较大比例。由于蜂蜜产量有限,且易受到气候、蜜源植物生长状况等因素的影响,蜂蜜产量常出现波动。蜂蜜资源的有限性与市场需求间的矛盾致使以次充好,或在天然蜂蜜中掺入各种低廉的果葡糖浆、麦芽糖浆等掺杂蜂蜜的状况十分严重。大量品质低劣的掺杂蜂蜜严重损害了蜂蜜产品的质量。建立有效、简便快速的蜂蜜掺杂检验方法,对维护和保护消费者的利益、保证中药制剂的质量具有重要的意义。蜂蜜国家强制性标准(GB18796-2005)［1］,增加了对蜂蜜的真实性要求,明确规定蜂蜜产品中“不得添加或混入任何淀粉类、糖类、代糖类物质”,并规定了对蜂蜜掺假的检测方法和判定原则。蜂蜜真伪鉴别方法已有较多的研究,如稳定碳同位素比率法(GB/T18932.1)［2］、薄层色谱法测定蜂蜜中高果糖淀粉糖浆(GB/T18932.2-2002)［3］和离子色谱法测定蜂蜜中淀粉糖浆(GB/T21533-2008)［4］等等。本文参照GB/T18932.2-2002［3］和文献[5-6]薄层色谱法的前处理方法,采用活性炭柱-硅藻土柱(SPE小柱)处理样品,纯化、富集寡糖成分,分别试验比较了薄层色谱(TLC)和高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)的分离和检测方法,通过检测寡糖的存在鉴别蜂蜜的真伪［7］。34份不同来源的样品分析结果显示,TLC法快速简便;HPLC-ELSD方法灵敏度较高,可以作为进一步的验证方法。1材料、试剂与实验用水Waters2690高效液相色谱仪,Alltech2000ES蒸发光散射检测器;CAMAG薄层色谱系统(包括半自动点样器,成像仪、加热器);固相萃取装置(安捷伦科技有限公司)。对照品果糖(批号111504-200001)、麦芽糖(批号100287-200701)、麦芽三糖(批号100274-200601)均由中国食品药品检定研究院提供;麦芽四糖(批号OM027960801)、麦芽五糖(批号OM068720901)、麦芽六糖(批号OM068690802)、麦芽七糖(批号OM068680801)均购自CarbosynthLtd。SPE空柱管(Cat:Az006,spec:6mL,AgelaTechnologies),筛板(As006-A,spec:1ue4d416”-6;As006-B,spec:1ue4d48”-6,AgelaTechnologies);硅胶GF254薄层层析预制板(100mm×100mm,青岛海洋化工厂分厂);MerckTLCSilicagel60(100mm×100mm,Merck公司);MNHPTLC(100mm×100mm或200mm×100mm,Macherey-Nagel公司);MerckHPTLC(100mm×100mm,Merck公司);Celite545硅藻土;粉末活性炭(天津市塘沽滨海化工厂)。乙腈为色谱纯(Fisher),乙醇、丙酮(北京化工厂)及二苯胺、苯胺、磷酸(国药集团化学试剂有限公司)均为分析纯。实验用水为Milli-Q系统制备。部分蜂蜜样品由北京同仁堂集团有限公司提供,部分蜂蜜样品由湖南省食品药品检验研究院、重庆市食品药品检验所和西安市药品检验所协助在辖区生产企业收集,部分蜂蜜样品购自北京、四川、陕西等地药店。2.1.1对照品溶液ml精密称取果糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的对照品适量,分别加水制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液(TLC用)。分别取上述对照品溶液适量(麦芽糖0.1mL、麦芽三糖0.2mL、麦芽四糖0.3mL、麦芽五糖0.4mL、麦芽六糖0.5mL、麦芽七糖1mL),加水定容至10mL,作为麦芽糖混合对照品溶液(HPLC用)。2.1.2试验溶液2.2tlc法2.2.1乙胺-正丙醇-水-水分离三乙胺-正丙醇-水分别试验考察了展开剂系统:甲酸-正丁醇-水(6∶4∶1)、三乙胺-正丙醇-水(0.7∶60∶10)、三乙胺-正丙醇-水(0.7∶60∶30),结果三乙胺-正丙醇-水(0.7∶60∶30)展开系统斑点清晰,分离效果好。2.2.2tlc试验结果将供试品溶液以及果糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的对照品溶液分别点于硅胶GF254、MerckTLCSilicagel60、MNHPTLC、MerckHPTLC薄层板上进行TLC试验,结果高效薄层板分离斑点清晰,分离效果好,比移值适合,优于普通薄层板。见图1。2.2.3乙胺-正丙醇-水经比较不同规格的薄层板和展开剂系统,确定采用以下TLC条件:MerckHPTLC薄层板;展开剂:三乙胺-正丙醇-水(0.7∶60∶30);显色剂:苯胺-二苯胺-磷酸溶液(取二苯胺1g,苯胺1mL,磷酸5mL,加丙酮至50mL,配制成溶液),加热至斑点显色清晰。供试品溶液与对照品溶液点样量:3μL。2.2.4麦芽糖浆添加量的确定在正常蜂蜜样品中添加不同比例的麦芽糖浆,考察检出情况。取“2.1.2.4”项下模拟样品溶液,按“2.2.3”项下条件进行TLC试验,结果显示添加麦芽糖浆为5%的模拟样品未检出明显的五糖以上斑点,而添加麦芽糖浆为10%、20%、30%的模拟样品,斑点逐渐加深,初步确定TLC可检出添加麦芽糖浆10%的样品。见图2。2.2.5yratees-3-流动相、温度和色谱图称取麦芽糖浆样品2g,平行称取6份,分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.2.3”项下条件进行TLC试验,结果显示6份供试品溶液无明显差区别。色谱柱:PrevailCarbohydrateES5u(4.6mm×250mm,5μm);流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~40min,75%A→55%A,25%B→45%B);流速:1mL·min－1;柱温:30℃;蒸发光散射检测器漂移管温度:95℃;气体流速1.8L·min－1;进样量:10μL。在上述色谱条件下,对照品、空白样品、蜂蜜样品(天然蜂蜜)、蜂蜜(麦芽糖掺伪样品)、麦芽糖浆、果葡糖浆色谱图见图3。由图3可见,天然蜂蜜样品(图3-c)未检出五糖以上寡糖,而其他糖浆和掺伪样品(图3-d、e、f)可检出五糖以上寡糖。2.3.2hplc-elsd试验取“2.1.2.4”项下制备的模拟样品溶液0.5mL,加30%的乙醇溶液稀释至1mL作为HPLC-ELSD模拟样品溶液。按“2.3.1”项下条件进样,结果见图4。由图4可见,添加麦芽糖浆为1%的模拟样品,麦芽五糖色谱峰保留时间以上无明显色谱峰出现,而添加麦芽糖浆为5%、10%、20%、30%模拟样品五糖之后峰逐渐增高,由此判断检出限为5%。2.3.3结果lsd取“2.2.5”项下制备的6份TLC用重复性供试品溶液各0.5mL,加30%乙醇稀释至1mL,作为HPLC-ELSD重复性供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件进样检测。结果6份HPLC-ELSD重复性供试品溶液,色谱峰面积值的RSD分别为:麦芽三糖2.9%,麦芽四糖11.9%,麦芽五糖12.5%,麦芽六糖13.5%,麦芽七糖15.2%。随着色谱峰保留时间延长,峰面积值的偏差增大。可能的原因,除与保留时间延长,峰加宽有关,也可能与活性碳柱对不同寡糖的吸附能力有关。2.4蜂蜜收集结果采用上述TLC和HPLC-ELSD方法,共检测了34批蜂蜜样品,其中,在产地、蜂蜜加工企业以及药品生产企业收集22批,其余在药材市场和零售药店收集。检测出寡糖的样品有23批,占67.6%。2试验方法和结果2.1溶液的制备2.1.2.柱面活性炭子柱的制备在SPE空柱底部塞入1个筛板,压紧,置固相萃取装置上。称取硅藻土0.2g,加水适量混匀,用吸管加至SPE柱管中,自然沉降形成3mm厚的硅藻土层,打开真空泵吸引,称取活性炭0.5g,加10mL水搅拌混匀用吸管加入,在真空泵的吸引下使活性炭沉降,当水面接近活性炭层面时,再次注入0.2g用水混匀的硅藻土,在真空泵的吸引下,以每秒1滴的速度用25mL的水预洗,当液面到达柱面上2mm时关掉活塞,备用。2.1.2.tlc检查用供试品溶液称取蜂蜜(或麦芽糖浆、果葡糖浆)样品2g,置50mL烧杯中,加入10mL水溶解后,缓缓加至活性炭SPE柱中,打开活塞,在真空泵的吸引下,使溶液通过柱子,待液面下降到柱面以上2mm时,用7%乙醇溶液25mL洗脱,弃去洗脱液。再用50%乙醇溶液10mL洗脱,收集洗脱液,65℃水浴中减压浓缩至干,残渣加30%乙醇溶液1mL使溶解,作为TLC检查用供试品溶液;取TLC检查用供试品溶液0.5mL,加30%乙醇稀释至1mL,作为HPLC-ELSD法的供试品溶液。2.1.2.3-白色样品溶液的制备取水(不加蜂蜜)10mL,按“2.1.2.2”项下加至活性炭SPE柱中操作,同法制备空白样品溶液。2.1.2.蜂蜜样品及麦芽糖浆溶液的配制称取蜂蜜样品(TLC和HPLC-ELSD寡糖检测为阴性)10g,加水50mL溶解,即得蜂蜜样品溶液;另取麦芽糖浆2g,加水10mL溶解,即得麦芽糖浆溶液;按表1中的量将上述两溶液混合,即得模拟样品,按“2.1.2.2”项下加至活性炭SPE柱中操作,制备模拟样品溶液。2.3hplc-elsd法2.3.1条件13讨论3.1制备果葡糖浆通过五糖以上寡糖的检查判断蜂蜜的真伪主