食用菌栽培课件24

食用菌栽培课件24第九章菌种的分离、提纯、扩大、培养与保第一节菌种的分离与提纯进入课文三、菌种的提纯如果分离的菌种已污染，可以使用相应的办法除掉。

(一)使用抑制培养基(二)排除细菌或酵母菌污染(三)排除霉菌污染(四)菌丝再提纯(五)单根菌丝提纯技术(六)菌丝生长速度、生长量的测试使用抑制培养基从腐朽严重的木材块上分离菌丝时，新生菌常会伴随着各种各样的细菌、霉菌出现。在这种情况下，可向培养基中加入选择性强的抗菌剂，如涕必灵(TBZ)或多菌灵(MBC)。抗细菌的如培养基加入30mg/L左右的四环素或氯霉素等，以抑制细菌的出现。此外，也可以在培养基内添加链霉素30～40mg/L或金霉素20～30mg/L或高锰酸钾50mg/L。返回排除细菌或酵母菌污染

组织分离，基内菌丝分离将分离物接种在无冷凝水、硬度较高的斜面培养基上，再降低培养温度至15～20℃。利用某些大型真菌在较低的温度下，菌丝生长速度比细菌菌苔蔓延速度快的特点，用尖细的接种针切割菌丝的前端，转接到新的试管斜面培养基中培养，连续2～3次就能获得所要的纯菌丝。也可以用接种铲将斜面污染的细菌菌苔铲除掉，打破试管，挑取内部有基内菌丝的琼脂块，移入无冷凝水的培养基上。适合于菌龄较长、被好气性细污染的试管。

返回排除霉菌污染分离培养后，若发现有色的霉菌小斑点污染，最好放弃。如由同一材料分离得来的，每支试管都是如此，那就要重新分离。如果霉菌菌落刚出现孢子，孢子尚未成熟，尚未变色，则可采用前端菌丝切割法提纯。如果霉菌菌落的颜色已加深，则意味着众多的孢子已成熟，若采用前端菌丝切割法提纯意义不大。可将1%多菌灵的湿滤纸盖在霉菌的菌落上，以防止提纯时，试管振动使孢子扩散。然后，用火焰灭菌过的接种铲将分离物表层铲掉，随之，用另一接种针钩取分离物位置下的基内菌丝。霉菌的污染还常见于棉塞上，这多是棉塞受潮所致。返回(四)菌丝再提纯采用切割法或基内菌丝挑取法提纯后，一般都能获得纯菌丝，但也偶有提而不纯的现象发生，这就必须对菌丝再提纯。为了判断提纯后菌落的纯度，将菌丝块接入琼脂培养皿平板培养基内，如果纯种菌丝，菌落会逐渐向四周辐射状散开，外缘整齐，如果菌种不纯，混有其它丝状真菌，菌丝生长速度不一，菌落外缘便参差不齐，培养皿内产生的色素也分布不匀。再提纯时，对菌落中生长速度较为一致的部分施行菌丝前端切割，移植至新的培养基。返回单根菌丝提纯技术将怀疑混有杂菌的菌丝，用尖细的接种针切割带有培养基的菌落前端2～3mm2的薄片，移接入PDA培养基，每支试管可移接数点，放在所分离的菌种的最隹温度下培养，隔12小时后，在阳光下观察各接种块菌丝生长的状态。选取菌丝显现出分叉状，用锋利的接种针仔细地将贴在培养基面上的单根菌丝带培养基切割下来，移入PDA培养基内，塞上棉塞，再用放大镜观察判断是否为单根菌丝，则应继续培养12～24小时后，再重复上述过程。适合于菌丝生长速度快，密度不高的菌类，如草菇返回菌丝生长速度、生长量的测试菌丝生长速度或生长量的测定常用于判断菌种生长能力的优劣或在不同营养、环境条件下适应能力的高低。将适合测试菌类的培养基填入25㎜×25㎜试管内，取略小于试管口径的小木棒轻轻插入，竖立，在木棒上方加适当的重力。再抽出木棒，洗净试管口，擦干，塞上棉塞，置入手提式高压灭菌锅中，常规方法灭菌。灭菌时间为1小时，取出冷却，即成相接近密度的培养基柱。下一页菌丝生长速度、生长量的测试在无菌条件下，接入菌龄长短一致，接种块大小尽量一致的菌丝块。竖放并适温培养。待菌丝蔓延1cm左右，用记号笔在试管上沿菌丝前沿画线。数日培养后，再划出终止线，这样就容易计算出日生长速度。每样品重复3次。通过不同样品间的比较，就能从中弃弱留强。但必须指出，菌丝生长速度量快的，并非出菇最快。产量与质量皆好的菌株，还要进一步做试验，确定。第二节菌种的扩大、培养一、菌种的扩大经分离、提纯、出菇试验确定为生产用种后，为了适应生产栽培需要，要进行菌种的扩大、繁殖。二、贴标签无论是菌种分离、提纯，还是一级、二级或三级种的扩大，无菌操作后应马上贴标签。三.菌种培养培养室内温度、湿度、光照、空气等条件彼此联系，互相影响。(一)一级菌种的扩大培养1.单一菌丝类型一级菌种的扩大培养(1)单一菌丝类型一级菌种接种无菌操作要点a在无菌箱内，将待接的斜面试管(无冷凝水)、购来或自行培养好的一级原始种，酒精灯、火柴盒、接种针等放入接菌箱内。下一页单一菌丝类型一级菌种接种无菌操作要点b按接种箱操作规程进行消毒。c打开工作灯，用75%的酒精棉球擦双手，伸入接种箱内，再擦接种工具。d点燃酒精灯。5右手持接种针，将顶端烧红，并将整支接种针过火几次。6用左手手指和手掌托持两支试管，食指与中指与中指夹持一级原始种，无名指和小指夹持空白斜面培养基试管。用右手无名指和小指夹持原始种棉塞，小指和鱼际夹持空白试管棉塞。火焰封口双管。下一页单一菌丝类型一级菌种接种无菌操作要点7将接种针靠在试管内壁冷却，然后挑取一小块基内菌丝琼脂块，迅速移接到空白斜面中央。棉塞燎考至微焦，塞回试管口上。右手用接种针伸入管内挑，持住原始一级种试管，保持火焰封口状态，左手将接好的试管放下，重新取一空白试管，重复上述操作，直至一级菌种用完为止。下一页(2)注意事项

接种过程中，注意保持试管与桌面接近平行，试管口略向下倾斜，不要远离酒精灯火焰。周而复始。一支一级菌种可扩展几十支试管。气生菌丝旺盛的菌类，如蘑菇、茯苓、，应将气生菌丝掉，用基内菌丝移接。不同菌类移接用的接种块大小与转管培养后菌种商品外观和质量有关。一般蘑菇、一级菌种转管时，接种块越小越好，这样移接后气生型菌丝不易倒伏。下一页2混合型菌丝一级种的扩大培养

银耳纯白菌丝生长缓慢。为了单独获得银耳纯菌丝和为了提纯羽毛状菌丝，常在耳木分离时将两种菌丝分别分离出，并分开扩接。使用时从纯白团四周晕圈处钩取小米粒大小带培养基的菌丝体移入新培养基内，24℃培养一周后，再在离银耳纯白菌丝团外沿2cm处接入一小点羽毛状菌丝，再继续培养一周左右，就可以扩接二级菌种。下一页(二)二级菌种的扩大培养1.单一菌丝类型二级菌种的扩大培养将灭菌好的二级菌种培养瓶数十瓶(视接种箱的大小)连同接种工具、一级菌种放入接菌箱内，按常规进行熏蒸消毒。按无菌操作要求，在接种箱内将接种针进行火焰灭菌、冷却。将一级菌块划成1㎝大小的接种块，用接种钩钩住，弯钩朝上，左手持二级菌种瓶横放，用右手小指和鱼际抓住棉塞，左手将二级种瓶反时针旋转后退，拨脱棉塞，火焰封口。下一页二级菌种的扩大培养将已钩取的菌种块抖入二级菌种瓶，塞上棉塞。经摇二级菌种瓶，使菌种块滚至培养基面中央。按此法每支试管可接二级菌种瓶8～10瓶。操作时注意：不能将二级种瓶口朝上，同时注意拨出棉塞后，不能碰到其它器具及接种箱壁。若接种块掉在箱底上，应弃之不用。每接完一支一级种，接种工具应重新火焰灭菌。待整箱二级菌种瓶全部接完后，开启箱盖。下一页2.混合型二级菌种的扩大培养混合型原种的接种和单一型二级种接种的方法大同小异。显著不同的是：银耳一级种培养基的前后端应弃之不用，仅要绣球状银耳纯白菌丝及附近长有黑灰色羽毛状菌丝的菌块。按上述方法，连同培养基整块钩取出，移入菌种瓶内，每支试管仅能接一瓶二级菌种，不能贪多。接完二级菌种，用手拍打，振动瓶，使一级菌种块纯白菌丝面朝上，千万不能朝下，否则报废。

下一页混合型二级菌种的扩大培养培养温度初期27～28℃，促使羽毛状菌丝蔓延，5～6天之后马上降至22～23℃，这是纯白菌丝生长适宜的温度。接种后培养20～25天，接种块逐渐形成胶质化的原基团，并吐出水珠，适合作为段木银耳种，菌龄控制在40～45天。若在同样的温度下，12～13天胶化，并逐渐开片，吐黄水，则适合作为代料棒栽银耳种，菌龄控制在15～18天内使用。

下一页(三)三级种扩大培养三级种是用培养好的二级种进行扩大培养。1单一菌丝型三级种的接种待接栽培瓶横放入接种箱左边，选无污染的二级菌种瓶置于接种架上，同时将一团浸有95%酒精的棉花团，长柄摄子、接种匙、接种架酒精灯、火柴等一起放入接种箱内，按常规方消毒。接种时用长柄摄子夹紧酒精棉花团，打开二级种瓶的棉花塞，将棉花团点燃，在瓶口附近燃烧，进行瓶口消毒，然后置于接种架上火焰封口。下一页三级种扩大培养然后接种匙火焰灭菌后将二级种表面的培养基扒掉，再将下面长满菌丝的培养基在瓶内挖碎。接种匙插放在二级菌种瓶内，置于接种架上，左手持三级种瓶，右手小指及手掌鱼际夹住棉塞旋转打开，靠近二级种瓶口，然后用接种匙铲取一满匙，移入三级种瓶内，再塞紧棉塞，接种完毕，竖放在接种箱右边。周而复始。接种完毕取出，贴上标签，轻振使一部分二级菌种块落入种穴，一部分布满表面。排入培养室。每瓶二级菌种可接25～30瓶三级种。下一页2.混合型三级种的扩大培养将待接三级种瓶及接种匙等工具放入接种箱内，进行常规消毒，其操作过程和上述单一菌丝型三级种扩接一样，最的不同点是：用接种匙将瓶内银耳原基铲平，挖出子实体原基，弃之，将子实体下面2～3cm内较结实的菌丝块，用接种匙捣碎。然后挖取耳基周围几匙的木屑，捣碎，两者混合均匀。下一页混合型三级种的扩大培养接种匙铲接量只需蚕豆大小，移入三级种瓶内，每瓶二级菌种可接3～4瓶三级种，其余弃之不用。因银耳是混合型的，纯白菌丝仅生长在表面浅层培养基内，又由于羽毛状菌丝繁殖十分迅速，所以银耳培养基装料只需装1/4瓶即可。移接中注意防止烫伤菌丝。返回二、贴标签一级种试管标签应贴在前端，既不能遮住棉塞，又不遮住培养基斜面的部位，以免在检查棉塞和斜面是否污染时千万不便；二级、三级种标签多贴在瓶上部侧壁；塑料袋难贴标签，可将标签贴在塑料套环上。出可用记号笔将标签内容写在塑料袋外。标签内容注明菌种名称、菌株号、接种者或单位接种日期四项。菌种名可用中文注明，也常用拉丁文学名的缩写注明。习惯上常用的缩写字母。

下一页贴标签菌种名多写在标签的第一行，字体较大。菌株号是某一菌种特定菌株代号，更多的是用有一定代表意义的数字表示，它一般要求用较小号的字符写在菌种之后。购买一级菌种代号不宜自行更改。接种者或单位是注明该菌种制作责任人。接种日期菌种使用时作为推算菌龄的依据。科研上，育种上的标签一般较复杂，内容较多，除上述内容外，还要注明分离方法如孢子分离(S)、组织分离(T)、基内菌丝分离(M)等。返回菌种培养培养室内温度、湿度、光照、空气等条件彼此联系，互相影响。1.温度控制培养室内温度应根据季节变化进行控制，并结合培养阶段确定培养温度。(1)冬季保温、夏季降温冬季气温低，菌种培养室要有保温措施，使培养室温度保持在25℃左右，不保温浪费然。夏季菌种呼吸产生热量，使培养室温度升高，可