基因和基因工程

基因和基因工程基因和基因工程第1页一、基因基础概念1822年7月22日生于奥地利莫拉维亚省海因岑多夫村一个贫苦农民家庭；1828年，6岁孟德尔开始接收系统小学和中学教育；1840年，以优异成绩高中毕业，进入厄尔姆兹哲学学院进行了两年大学预科学习；1843年秋，进入布隆市奥古斯汀基督教修道院当一名修道士，取教名格里高，时年21岁；1.孟德尔遗传因子与基因（1）孟德尔生平介绍

基因和基因工程第2页1847年，被任命为神父；1849年，被委派到中学任希腊文和数学代课老师；1851年，在修道院资助下，进入维也纳大学深造；1854年夏天，大学毕业，回到奥古斯汀修道院，开始了人生新篇章；1856年，开始长达8年之久豌豆杂交试验；（修道院后花园）1865年，在布隆市自然科学研究协会年会上，公布了他研究结果和理论解释；1866年，发表著名论文《植物杂交试验》，首次提出了遗传因子、显性性状和隐性性状等遗传学概念；1868年，当选奥古斯汀修道院院长，今后再也无力从事研究；1884年1月6日逝世！基因和基因工程第3页后人在分析孟德尔成功发觉遗传第一定律和第二定律原因时，一致认为选择豌豆为试验材料含有决定性意义。那么豌豆含有什么样生物学特征呢？（2）豌豆生物学特征

基因和基因工程第4页a.不一样豌豆品系之间，通常存在着差异显著、易于区分而又稳定遗传相对性状特征；（开紫花豌豆植株）b.豌豆花结构比较特殊，含有雄配子花药和含有雌配子胚珠是由花瓣包裹着。所以它是一个严格自花授粉植物；（豌豆花结构）c.豌豆含有较大型花器官（即生殖器官），便于去雄，进行人工授粉试验。（豌豆人工授粉）基因和基因工程第5页（3）孟德尔单因子豌豆杂交试验

－－遗传因子分离定律

1856年至1863年，孟德尔在奥古斯汀修道院后花园进行了长达8年豌豆杂交试验。他首先选择了七对区分分明而又能稳定遗传性状作仔细观察。这七对性状是：花着生部位……腋生和顶生种子形状……圆形和皱形种子内部颜色……黄色和绿色花朵颜色……紫色和白色植株茎杆长度……长茎和短茎成熟豆荚外形……饱满和节缩未成熟豆荚颜色……绿色和黄色基因和基因工程第6页Table1.AsummaryofthesevenpairsofcontrastingtraitsandresultsofMendel’ssevenmonohybridcrossesofthegardenpea(Pisumsativum)基因和基因工程第7页

（4）孟德尔双因子豌豆杂交试验数据统计

世代种子表型种子数量百分比亲代

绿圆×黄皱－－F1代

黄圆－－F2代

黄圆3159.84黄皱1013.16绿圆1083038绿皱321.0总数556基因和基因工程第8页（5）遗传因子自由组合定律：依据上述试验结果，孟德尔推想：由两对等位因子杂交产生杂种F1代植株，在形成配子过程中，两对等位因子分离是彼此独立互不相关，而在形成合子过程中，不一样因子之间又是自由组合。这就是所谓遗传因子独立分配律，或叫自由组合律，亦即是孟德尔第二定律。孟德尔还进行了多因子豌豆杂交试验，其结果即使比较复杂，但它一样遵照遗传因子独立分离和自由组合标准。基因和基因工程第9页

（6）孟德尔遗传因子被正式定名为基因

1909年，丹麦一位生物学家约翰逊，依据希腊文“给予生命之义”创造了“基因”这个名词，用来代替孟德尔“遗传因子”。不过需要指出，约翰逊当初所说基因，并不代表遗传物质实体，只是一个与细胞任何可见形态结果均无关系抽象单位，也就是遗传性状符号！基因和基因工程第10页2、摩尔根基因论

（1）摩尔根生平介绍1866年9月25日，ThomasHantMorgan出生于美国肯塔基州列克星敦市一个富裕家庭。1880年，14岁少年摩尔根考入肯塔基州立学院预科班学习，两年后转入本科。1886年，以全班第一名成绩从肯塔基州立学院毕业，进入约翰.霍普金斯大学从事试验胚胎学研究；基因和基因工程第11页1890年，在约翰.霍普金斯大学获理学博士学位；1891～1903年，在布林莫尔女子学院任教，同时在其它一些研究机构从事胚胎学方面研究；1904～1928年，担任哥伦比亚大学动物学教授，进行遗传学与进化论领域科学研究；1927～1931年，担任美国科学院院长；1928年退休，同年发表名著“基因论”；1928～1945年，任加州大学生物学主任；1930年，担任美国科学促进联合会主席；1933年，获诺贝尔生理学及医学奖；1945年12月4日，因动脉血管破裂在美国加州帕萨迪纳市逝世。基因和基因工程第12页（2）果蝇生物学特征

a.繁殖能力强，产卵数量多；b.繁殖速度快，世代时间短（9天左右）；c.染色体数目少，仅4对，且形态各异，易于识别；d.拥有大量各种突变体；e.个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。基因和基因工程第13页（3）果蝇染色体组

性染色体――指与生物个体性别决定有直接关联染色体。比假如蝇X染色体和Y染色体。

常染色体――除了性染色体之外，不直接参加生物个体性别决定染色体叫常染色体。比假如蝇第II对，第III对染色体，均为常染色体。果蝇有4对染色体，其中1对为性染色体，其余3对为常染色体。基因和基因工程第14页

（4）果蝇眼色基因性连锁遗传1910年，摩尔根及其助手从红严果蝇群体中发觉了一只白眼雄果蝇，他们将白眼雄果蝇同来自同一父母姊妹红眼雌果蝇交配，结果产生F1代果蝇，不论是雄还是雌，无一例外都是红眼。这个结果说明：a.

果蝇红眼是显性性状，白眼是隐性性状；b.

亲代白眼雄果蝇是隐性纯合子；c.

亲代红眼雌果蝇是显性纯合子；摩尔根等人将上述所产生F1代红眼雄果蝇同红眼雌果蝇相互交配，产生子二代（F2）果蝇中，红眼同白眼百分比恰好为3:1。但有趣是，全部白眼果蝇都是雄性，没有一只是雌性。基因和基因工程第15页这说明：白眼性状与性别有联络，摩尔根等人推测控制果蝇白眼隐性基因是位于X染色体上。摩尔根等人工作，第一次将代表某一特定性状基因，同某一特定染色体联络起来了，从而建立了基因遗传物质基础，建立了基因染色体理论，使基因学说得到了普遍认可。基因和基因工程第16页（5）连锁与交换定律

基因连锁与交换定律，是由美国著名遗传学及胚胎学家摩尔根与他学生所建立。因为该定律极大地完善并丰富了孟德尔遗传学理论，因今后人将它与孟德尔第一遗传定律、第二遗传定律并列，称之为遗传学第三定律。基因和基因工程第17页（6）摩尔根学术贡献

摩尔根及其学术工作，第一次将代表某一特定性状基因，同某一特定染色体连系了起来，从而确证了基因遗传物质基因，建立了基因染色体理论，为基因工程建立作了卓越贡献。摩尔根生活低调，衣着朴素，热心科研，勤奋工作，知道38岁才与其女友结婚。为了不影响科研工作，摩尔根借故没有出席诺贝尔奖颁奖仪式。他总结自己为何会在科学研究中作出很多发觉原因时说“一靠勤奋，二靠试验材料得当，三靠愿意放弃没有任何证据假说，最终还得少开些遗传学大会”。基因和基因工程第18页3.基因载体是DNA

在孟德尔和摩尔根基因论被科学工作者广泛接收之后，关于基因载体（或说是化学本质）是DNA还是蛋白质，一直存在着两种不一样意见。（1）1944年，O.Avery等人肺炎链球菌毒性转化试验证实，基因载体是DNA，而不是蛋白质。S型肺炎链球菌――具荚膜，光滑，有毒。R型肺炎链球菌――无荚膜，粗糙，无毒。基因和基因工程第19页结论：使肺炎链球菌毒力性状发生转化因子是DNA，而不是蛋白质。这有力地证实基因遗传载体是DNA而不是蛋白质。基因和基因工程第20页（2）1952年，A.DHersheyandM.Chase应用放射性同位素双标识技术，证实菌体遗传物质（基因载体）也是DNA而不是蛋白质。试验现象：用放射性同位素32P和35S分别标识噬菌体内部DNA和外部蛋白质，然后感染寄主细胞。结果发觉只有32P标识DNA注入大肠杆菌细胞。结论：在噬菌体中，基因载体也是DNA而不是蛋白质。基因和基因工程第21页

DNA分子半保留复制模型（3）1953年，J.Watson和F.Crick建立了DNA双螺旋模型；1958年，M.Meselson和F.W.Stahl在此基础上发觉了DNA分子半保留复制机理。从而处理了基因自我复制和代代相传问题。至此，基因分子本质是DNA而不是蛋白质已是不争事实！基因和基因工程第22页4.基因编码产物

基因是细胞中全部RNA及蛋白质分子“蓝图”，有些基因编码最终产物是RNA分子，比如rRNA基因、tRNA基因及其它小分子量RNA基因等；而其它一些基因编码最终产物是蛋白质，这些蛋白质是经过mRNA中介合成。基因和基因工程第23页5.遗传密码破译－－DNA核苷酸次序与蛋白质氨基酸次序关系

Beadle、Tatum和Ingram等人工作，即使确立了基因（DNA）与蛋白质多肽链之间关系，也就是说蛋白质是由基因编码，不过，基因DNA分子是由4种不一样核苷酸（A、T、G和C）排列组合而成，而蛋白质分子中多肽链则是由20种氨基酸排列组合而成。那么基因DNA分子中核苷酸碱基次序，同蛋白质多肽链中氨基酸次序之间存在着什么样关系呢？遗传密码破译正确地回答了这个问题。基因和基因工程第24页（1）中心法则1958年，F.Crick提出了解释DNA，RNA及蛋白质三者关系所谓中心法则：DNARNA蛋白质依据中心法则DNA会自我复制，而RNA及蛋白质二者都不能够自我复制，所以生物体中能够永久保留代代相传下去是DNA分子，或说是基因。基因和基因工程第25页DNA在复制过程中双链解开，以单链形式作为合成自己互补链（cDNA）模板，其碱基配对标准是：

腺嘌呤（A）－胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）－胞嘧啶（C）在DNA到RNA转录过程中，单链cDNA则是作为指导RNA合成模板。RNA可分成tRNA、rRNA、其它小分子RNA和mRNA，其中只有mRNA可转译成蛋白质。转录过程中碱基配对标准：

腺嘌呤（A）－尿嘧啶（U）鸟嘌呤（G）－胞嘧啶（C）基因和基因工程第26页（2）遗传密码遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质过程，叫作基因表示。它包括遗传信息转录和转译两个步骤。转录――依据碱基互补标准，遗传信息从DNA核苷酸序列形式转换成RNA核苷酸序列形式过程叫作转录，也叫RNA合成。转译――遗传信息从mRNA核苷酸序列形式，转变成蛋白质多肽链氨基酸序列形式过程叫作转译，也叫蛋白质合成。基因和基因工程第27页

当咱们思索转录和转译这两个过程时会发觉，转译与转录不一样，它不是简单核苷酸序列转换过程，而是将mRNA分子上核苷酸语言翻译成蛋白质多肽链上氨基酸语言负责过程，是包括到两种不一样语言信号之间更换问题。所以，在从mRNA到蛋白质多肽链转译过程中，必定存在着一个特殊遗传密码系统，才能够将RNA分子上核苷酸次序，同蛋白质多肽链分子上氨基酸次序联络。这种遗传密码在1966年已经完全破译。基因和基因工程第28页（3）通用遗传密码表

第一位字母（5’-

末端）第二位字母第三位字母（3’-末端）UUCAGUCAGPhePheLeuLeuSerSerSerSerTyrTyrStopStopCysCysStopTrpCLeuLeuLeuLeuProProProProHisHisGlnGlnArgArgArgArgUCAGAIleIleIleMetThrThrThrThrAsnAsnLysLysSerSerArgArgUCAGGValValValValAlaAlaAlaAlaAspAspGluGluGlyGlyGlyGlyUCAG注1.Met和Val密码子AUG和GUG，也叫起始密码子，表中加方框表示。注2.UAA、UAG及UGA三个密码子为终止密码子，表中以“Stop”表示。基因和基因工程第29页6.基因结构

按照细胞中是否存在真正有形细胞核结构，可把生物分成真核生物和原核生物两大类。比如大肠杆菌细胞中染色体并没有被核膜包围，所以没有真正有形细胞核结构，属于原核生物。而诸如高等植物和动物，细胞中染色体被核膜包围成一个有形细胞核结构，属于真核生物。与此对应，也可把基因分成真核基因和原核基因两大类，二者在结构上是有差异。基因和基因工程第30页（1）基因基础组成个别

不论是真核基因还是原核基因，都含有以下4个基础组成个别：a.编码区――包含起始密码子，终止密码子和氨基酸密码子；b.非编码区――5’-末端非转译区，3’-末端非转译区，真核基因间隔区；c.开启区――RNA聚合酶结合部位，由此开启基因转录作用；d.终止区――含有终止转录作用功效。基因和基因工程第31页（2）原核蛋白质编码基因结构

基因转录区开启子终止子转录ATGTAA5’-UTR3’-UTR转录终止位点RNA起点核糖体结合位点基因和基因工程第32页（3）真核蛋白质编码基因结构

基因转录区开启子终止子转录ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点初级RNA转录本剪辑ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点核糖体结合位点mRNA基因转录区开启子终止子转录ATGTAA5’-UTR3’-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点初级RNA转录本剪辑ATGTAA5’-UTR3’-UTRRNA起点mRNA外显子内含子基因和基因工程第33页

二.基因工程原理1.基因工程诞生基础

（1）基因工程诞生理论基础a.在上世纪40年代确定了遗传信息携带者，即基因分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传物质基础问题。

b.在上一世纪50年代揭示了DNA分子双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而处理了基因自我复制和遗传传递问题。

c.在上世纪50年代末期和60年代早期，科学工作者相继提出了“中心法则”、“操纵子学说”，并成功地破译了遗传密码，从而说明了遗传信息流向和表示问题。

基因和基因工程第34页小结：基因工程诞生理论基础是

（a）基因分子载体是DNA而不是蛋白质，

从而处理了遗传物质基础问题。（b）DNA双螺旋结构模型和半保留复制机理，

从而处理了基因自我复制和遗传传递问题。（c）“中心法则”、“操纵子学说”和遗传密码破译，

从而处理了遗传信息流向和表示问题。基因和基因工程第35页（2）基因工程诞生技术基础：（a）DNA分子体外切割与连接技术建立；

（b）DNA分子核苷酸序列测定方法创造；

（c）大肠杆菌遗传转化技术建立；

（d）琼脂糖凝胶电泳技术建立与应用；

（e）核酸杂交技术建立，(DNA片段分离和酶切图谱构建等)(Southern和Northern杂交术)。基因和基因工程第36页2.基因工程（Geneengineering或geneticengineering）

定义：在体外试管中应用DNA重组技术将外源核酸分子（基因）插入病毒、质粒或其它载体分子，组成遗传物质重组体，并使之转移到原本没有这类分子（基因）受体细胞内，而能连续稳定地繁殖与表示。这么过程叫做基因工程，有时也叫做遗传工程。基因和基因工程第37页

（1）基因克隆与DNA克隆a.在DNA克隆中插入载体DNA片段，绝大多数是不含有基因编码序列，或者说是不含有完整基因编码序列。b.拿人基因组DNA为例，全长达3×109bP

，但其中基因编码序列不到2%。所以绝大多数DNA片段是不含有基因编码序列。b.基因克隆实质上是指应用类似于DNA克隆技术，分离纯化含目标基因DNA片段试验操作过程。基因和基因工程第38页

（2）“克隆”一词概念

在汉字中“克隆”一词兼具名词、动词和形容词三种不一样词义。“克隆”作名词使用时，是指从一个共同祖先无性繁殖而来一群遗传同一DNA分子、细胞或个体组成特殊生命群体；“克隆”作为动词使用时，则是指从同一祖先经过无性繁殖产生这类遗传上同一DNA分子、细胞或个体过程；在汉字中“克隆”还可作为形容词使用。比如克隆羊（Clonedsheep）。基因和基因工程第39页（3）名词“克隆”三种层次：个体水平┈含有相同基因型同一物种两个或多个个体。比如从同一个受精卵分裂而来同卵双生子（monozygotictwins），便是属于同一克隆；细胞水平┈从同一个祖细胞分裂而来一群遗传上同一细胞群体。（在细胞学、胚胎学中使用）；分子水平┈在分子生物学中特指带有一段插入DNA载体分子/寄主细胞单位。比如大肠杆菌寄主细胞中重组质粒载体，叫做克隆。基因和基因工程第40页（4）基因克隆步骤：

从所选取试验材料中分离、纯化基因组DNA，经适当限制酶消化切割，产生出DNA限制片段群体

↓（限制片断切割）在体外试管中将片段群体连接到载体分子上，形成重组DNA分子（重组体）混合物

↓（体外重组）将此重组DNA分子混合物转化到适当受体细胞，进行复制与繁殖

↓（遗传转化）从大量转化细胞群体（即DNA文库），筛选出获得重组DNA分子（含目标基因）转化子克隆

↓（转化子克隆筛选）从这些转化子克隆中，提取己经得到扩增目基因，供深入研究用

↓（目标基因分离）将目标基因亚克隆在表示载体上，导入受体细胞，使之在新遗传背景下实现功效表示，产生出人类需要产品（目标基因表示）。基因和基因工程第41页3.核酸内切限制酶-DNA分子“剪刀”（1）定义：核酸内切限制酶（Restrictionendonuclease），又叫做限制酶（Restrictionenzyme），是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割双链DNA分子核酸内切酶。所以有些人形像地将核酸内切限制酶形象地比作DNA分子剪刀。自然界中存在着大量核酸内切限制酶，迄今已经从各种不一样微生物中分离纯化出三千各种核酸内切限制酶。它们总共能够识别200种左右不一样特异性识别序列。 基因和基因工程第42页（2）几个常见限制酶识别序列

BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’HindIII5’-AAGCTT-3’

3’-TTCGAA-5’

PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’基因和基因工程第43页（3）DNA分子体外切割

a.体外切割――在体外反应体系中，在一定温度下保温（普通是37℃），核酸内切限制酶便能够对双链DNA分子进行切割作用。这种反应也叫作消化作用，或酶切消化作用。

b.粘性末端――DNA分子在限制酶作用下形成，含有互补碱基单链末端结构，它们之间能够经过互补碱基间配对作用而重新连接起来。基因和基因工程第44页c.EcRI酶切（识别位点为GAATTC）后，

形成5，-P单链粘性末端5’-GAGATCTTGAATTC

ATAAGTC-3’3’-CTCTAGAACTTAAG

TATTCAG-5’5’-GAGATCTTG-3，

3’-CTCTAGAACTTAA-P-5，＋

5，-P-AATTCATAAGTC-3’3，-GTATTCAG-5，基因和基因工程第45页d.PstⅠ识别位点及切割形成

3，-OH单链粘性末端↓5‘-GGCCTTCTGCAGAATCGG-3'3'-CCGGAAGACGTCTTAGCC-5‘

↑

↓

5'-GGCCTTCTGC-A-0H-3'3‘-CCGGAAG

＋

GAATCGG-3'

3'-0H-ACGT

CTTAGCC-5‘

基因和基因工程第46页（4）同裂酶、同尾酶和异裂酶a.同裂酶（Isoschizomers)含有一样识别位点，产生一样粘性末端，不过从不一样细分离出来，因而含有不一样名称一类核酸内切限制酶。比如HpaⅡ和MspⅠ就是一对含有一样识别序列：同裂同裂酶形成一样粘性末端，重组后识别序列不变！b.同尾酶（Isocaudamers）一组起源不一样、识别序列各异，但能够切割形成相同粘性末端核酸内切限制酶。比如BanHⅠ、BaglⅡ和Sau3A，即是组同尾酶，基因和基因工程第47页

（5）DNA连接酶（1）连接酶――能够利用ATP分子中γ-磷酸集团能量，经过催化两条并排DNA链5’-P-集团和3’-OH集团之间形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来核酸酶。（2）连接条件：

a.

被连接两条DNA片段，一条链3’-末端含有一个游离-OH集团；另一条5’-末端存在一个磷酸集团（P）。b.

在-OH和-P集团之间形成磷酸二酯键是一个需要能量过程（ATP）。c.最正确连接温度：4～16℃。基因和基因工程第48页4.基因克隆载体（1）基因克隆载体类型：

（a）质粒载体；（b）柯斯质粒载体；（c）λ噬菌体载体；（d）单链噬菌体载体；（e）噬菌粒载体；（f）酵母人工染色体载体（g）YAC后载体基因和基因工程第49页（2）质粒载体

（a）质粒（Plasmid）定义

普通指一类独立于细菌染色体DNA（染色体外）自主复制共价、闭合、环形双链DNA分子。（b）质粒普通特征

共价、闭合、环形双链DNA分子（covalentlyclosedcirculerDNA,cccDNA）除了酵母杀伤质粒RNA外，全部质粒都是DNA。

质粒DNA复制必须依赖于寄主细胞提供核酸酶及其它蛋白质分子。基因和基因工程第50页

（3）质粒DNA分子构型a.sc构型……即cccDNA所展现超螺旋构型，走在凝胶最前面；b.OC构型……即开环DNA（OCDNA）构型，其中一条DNA链保持完整环形结构，另一条链则出现一至数个缺口，走在凝胶最终面；c.L构型……发生双链断裂形成线性DNA构型。通称L型，走在凝胶中间部位。基因和基因工程第51页（4）质粒载体必须具备条件a.普通含有l个复制区或