体内药物方法的建立与验证

第四章

体内药物分析

方法的建立与验证4/30/20231体内药物分析分析方法的设计依据分析方法建立的一般步骤分析方法验证的内容与要求体内药物分析应用示例本章内容提要第四章分析方法的建立与验证4/30/20232体内药物分析第一节

分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件第四章分析方法的建立与验证4/30/20233体内药物分析一、待测药物的理化性质及体内存在状况准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物 ——预处理——待测物从结合物或缀合物中释放选择样品预处理方法——首先应考虑 ——待测药物的理化性质 ——药物在生物体内的存在状况 ——药物在生物体内的生物转化(代谢)途径第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/30/20234体内药物分析(一)待测药物的理化性质 药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——分析检测方法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定——避免高温蒸发溶剂第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/30/20235体内药物分析(二)待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 ——分离萃取方法

蛋白结合较强——不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物 ——分析检测技术

浓度较低（尤其有代谢产物共存） ——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用LC-MS、EIA等分析检测技术第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/30/20236体内药物分析二、分析测定的目的与要求

体内药物分析的目的——影响分析方法的应用

药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物

要求 ——同时测定原形药物和代谢产物

检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属 性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)

方法 ——不必强调方法的简便、快速； ——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/30/20237体内药物分析二、分析测定的目的与要求

临床治疗药物监测

有效治疗浓度范围内药物浓度

方法——尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 ——大多采用UV、RIA或EIA等

中毒患者的临床抢救

药物浓度极高

方法——不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 ——大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/30/20238体内药物分析三、生物样品的类型与预处理方法

生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用

以血浆或血清为分析样品

采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测

用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/30/20239体内药物分析四、实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/30/202310体内药物分析第二节分析方法

建立的一般步骤一、分析方法的选择二、分析方法的建立 (一)

检测条件的筛选 (二)分离条件的筛选第四章分析方法的建立与验证4/30/202311体内药物分析一、分析方法的选择

体内药物分析方法的设计 生物样品中的药物浓度——决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少 ——难以通过增加取样量提高方法灵敏度 ——通过选择适当的分析方法适应样品分析需求 体内药物分析中常用分析方法——特点见表4-1第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202312体内药物分析二、分析方法的建立分析方法建立之前 查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法 ——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202313体内药物分析二、分析方法的建立初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件

同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202314体内药物分析(一)检测条件的筛选

标准物质

——照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定

——确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度

HPLC——调整检测器(类型、条件)

色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)

流动相(组分及其配比)及其流速

柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等

——使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)

良好的色谱参数(n、R、T)

适当的保留时间(tR)第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202315体内药物分析(二)分离条件的筛选 在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下： 1．空白溶剂试验——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验——endogenouscompounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验——方法效能指标 4．实际生物样品测试——代谢产物(方法特异性)第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202316体内药物分析1．空白溶剂试验

待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） ——采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） ——测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）

考察目标

——方法的特异性

——空白值应尽可能小，并能有效校正第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202317体内药物分析色谱分析法

——可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型 ——空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R＞1.5）

本步骤主要考察 ——需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验

第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202318体内药物分析2.空白生物基质试验

空白生物基质(blankbiologicalmatrix) ——如空白血浆 ——照“1.空白溶剂试验”项下方法操作

考察目标 ——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性） ——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202319体内药物分析3.模拟生物样品试验

模拟生物样品(质量控制,QC样品)——空白生物基质中加入待测药物 ——照“1.空白溶剂试验”项下方法操作

考察目标 ——方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度

药物的萃取回收率等各项技术指标 ——同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/30/202320体内药物分析色谱分析继法——进一慰步考察待脊测药物(蹈或内标物永)与内源遣性物质(美或其它药买物)的分离情况——色谱陈峰的tR、n和T是否与水规溶液的一致色谱峰死是否为单一成章分标准曲线抓的截距是黄否显著偏离零症点等——内源性归物质是否对待律测药物或孕内标物质构成干贷扰第四章熊分析方员法的建立咐与验证第二节肺分堤析方法尚的建立训步骤4/2胖4/2接02321体内药物观分析4.纷实际生窄物样品六的测试空白生物室基质和模钥拟生物样香品试验—菌—确定的府分析方法叹及其条件——不塔能完全颂确认是红否适合抛于实际锯生物样站品的测估定——药物沙在体内可购能与内源哭性物质结岭合(如血浆蛋荷白结合连物)或代谢毕生成数题个代谢产物及其进一勤步的结合物(或缀合软物)实际生梦物样品——确立分析李方法后，尚需进驰行实际晨生物样冰品的测筐试考察目标——代谢产姜物对药物、锹内标物质奖的干扰情况——进尝一步验证方法开的可行性第四章艇分热析方法叮的建立任与验证第二节碰分析方喂法的建立衰步骤4/24下/202服322体内药阴物分析第三节分析方袭法摇验捉证的内萄容与要乖求用于实际蛮生物样品作分析之前——验证泄(va懒lid固ati厦on)分析方法滩的可行性与可靠性方法验杆证时应岸考虑影抚响分析枝方法——所陵有可变肤因素(灵采样,物样品制近备,色索谱分离传,检测顿与数据盗评价等贪)使用的技术指贩标——效能指省标使用的样品——通鼠常采用模拟生物浑样品和用药客后的实际生叫物样品第四章服分析方估法的建立具与验证4/24勾/202冈323体内药城物分析验证步搭骤首先为分析方铁法的验证——特异性痒、精密雷度与准咱确度、炊回收率定量限沉与检测艺限、溶姑液稳定酒性其次为生物基质起中待测药物稳定性的验证——室温放隆置、冷翁冻（或厌冷藏）慰、冻-笨融循环第四章衔分削析方法靠的建立掩与验证第三节达分析方室法的验证奔与要求4/2效4/2央02324体内药物衰分析验证的劈燕效能指寨标与基族本要求1．特异肢性——避肯免干扰2．标槐准曲线嫩与线性赵范围—要—覆盖所谷有浓度载范围3．准相确度—返—与实察际状况置相符4．精刻密度—租—结果静可重现5．定汤量限—您—达到轮峰浓度机的1/绍10～捉1/2解06．稳卵定性—塘—确保吼所有样夸品准确叛测定7．提浊取回收呈率——筑确保准善确度第四章途分析方烘法的建立烟与验证第三节凶分析方基法的验证匆与要求4/24觉/202券325体内药物房诚分析一、方法祝特异性(来专属性或达选择性)方法的特纱异性(spec缠ific拥ity)——又戒称专属钢性或专购一性，蹈通常与嗽选择性艳(sele起ctiv赚ity)互用——系指当有愚内源性物伯质存在时警，方法准孝确测定待证测物质的名能力专属性—餐—表示所拾检测的信号(响应)文系属于待测药漂物所特湾有的选择性—尖—系指将陪待测物质腿与其代谢缴物及同服卧的其它药桂物加以区分(将分离)圈的能力特异性——函候盖二者垄，以验证所测定吧的物质序与待测号药物的同一性考察一后个分析弹方法是尾否具有疑特异性年，应着禽重考虑拒以下几江点：第四章势分析方谢法的建立室与验证第三节灿分析方葱法的验证揭与要求4/24馋/202也326体内药腿物分析1.内餐源性物质易的干扰比较——待测药物原或其活性家代谢产物检测信号对照品筝（或标垒准品）空白生征物基质模拟生尼物样品股（空白紫生物基吧质中添左加对照金品）——如H扒PLC色淋谱峰的tR、n和T是否一致及与内尸源性物袋质色谱菊峰的R确证——内源性物凑质对分析赵方法有无干扰第四章资分析方虫法的建立礼与验证第三节卷分终析方法钞的验证锣与要求4/2娱4/2叫02327体内药滥物分析2.代尿谢产物的钞干扰比较——模拟描生物样品遣和用药后贼的实际生咳物样品的检测信号与代谢昼产物(锹在实际患样品中材tR随时间延罗长而增仅加)的R如HPL辞C色谱峰吸的tR、n和T〔或改变爷色谱条件摄(色谱柱乱)再比较己〕确证——其誓它代谢爬产物对辛分析方矩法有无干扰结构已知签的特定活冷性代谢物给的测定——必要雄时通过H埋PLC-琴DAD和逝LC-M主S确证色仔谱峰的单惜纯性和同渴一性对于结构棍未知的代乞谢产物的译测定——可赛采用L傲C-L乐C-N肌MR进严行结构留的初步佳推测后堡，考察粮其干扰菌情况第四章警分析方脏法的建立医与验证第三节怕分济析方法传的验证瘦与要求4/24访/202派328体内药示物分析3.伍馅用药物的奥干扰TDM时——还要湖考虑患者弄可能同时嗽服用药物慨(通常为挽数有限)振的干扰比较——待旨测药物难及可能塑同时服称用药物术的模拟胖生物样怠品的检测信号——如H明PLC色漫谱峰的tR、n和T是否一碑致确证——同予时服用纯药物对低分析方支法的干扰情流况第四章玻分析方捎法的建立说与验证第三节康分析方统法的验证药与要求4/24秆/202冤329体内药艘物分析4.庙与参比新方法的峰相关性除上述客方法外请，有时啊还可使访用参比方亩法对照参比方停法一般选仓用特异补性强、局准确度按高、线授性关系委良好的端色谱法——如在尿TDM中睬使用UV苏(或RI狸A)时,辟可以H鼠PLC(蜜或GC)泽为参比参比方法岛测定结果馆为横坐标驼(X);圾拟定方秃法结果含为纵坐提标(Y)用最小雄二乘法看计算回妖归方程Y＝a＋位bX(坐标标直度相等)相关系梦数(r)——表示两絮种方法证测得结鸽果的一忘致性——若r≠1，表示拟定帽方法为非东线性，如R撕IA中斑抗血清滴终度选择不丹当第四章榴分收析方法施的建立惜与验证第三节他分及析方法墙的验证袜与要求4/24米/202邮330体内药滔物分析4.拆与参比括方法的饺相关性Y＝a＋成bX截距(择a)——表示恩拟定方法馋受到恒定干扰的程度—相—内源性掉物质(UV)斜率(透b)——表示适拟定方法破受到比例干衣扰的程度店——标挥记抗原贸不纯(RIA)与参比毙方法的臭相关性继比较——除显棒示分析方南法的特异催性外——斜率b奥表示两调种方法馅测得结杯果的一洋致性若参比方停法准确度照良好——若截距a敬≈0,行则拟定方谦法的准确度(富回收率)软为100翅b(%)第四章防分析方缝法的建立敲与验证第三节酱分析方爆法的验证瓜与要求4/24版/202婆331体内药灿物分析二、标独准曲线肿与线性塞范围标准曲溜线（sta妈ndar朱dcu列rve）撒——c嫁alib另rati崇onc狗urve母or进wo俘rkin辜gcu岩rve——生荐物样品或中所测昂定药物吹浓度与蝴响应的相关性（比例的扩程度）——通常买用回归分和析方法所迟得的回归方遵程来评价——除今少数方赴法（免宴疫分析闲法）外施，标准欲曲线通歌常为线性模嚼式——回唱归分析鬼法为最小二乘醋法（le夸ast纽奉sq辟uar石es）或加权最小外二乘法（wei日ghte叨dle蚀ast孟squa铅res）线性范攻围（lin筑ear株rang籍）——标月准曲线的最高与最低浓度的区看间——模销拟生物浮样品的顽测定结汗果应达叨到试验黎要求的腿精密度阀和准确斤度第四章津分厉析方法铸的建立坟与验证第三节分分府析方法畅的验证易与要求4/24全/202楼332体内药物事分析二、标准与曲线与线谨性范围(震续)标准曲线因——用模拟生将物样品建立——线洪性范围盲(不包胁括零点)应能覆盖全丧部生物插样品中的药物龙浓度——不年能使用外推的方奶法求算未知李生物样品爱中的药物功浓度建立标廉准曲线祥所使用芒的模拟窄生物样投品——应使狠用与待测浙的含药生挖物样品相同的生翼物基质制备第四章爪分贩析方法音的建立西与验证第三节无分析方绵法的验证销与要求4/24辉/202肤333体内药捎物分析标准曲愈线的一疲般建立拢方法1.标准系列器溶液(非生物绳基质溶液边)的制备溶剂——水或甲弟醇（或其他斩适当溶剂粪）浓度——弊标准模拟术生物样品错中药物浓摘度的50倍敬以上加入量位为生物芝样品总防体积的2%以料下避免标准亮模拟生物东样品与实口际样品存迹在较大差钥异浓度较低——应除去溶险剂后再加入该生物基质否则,在循实际样品爪测定时应加入等体询积的溶剂并涡旋混形匀第四章桨分析方插法的建立旨与验证第三节烛分析方凯法的验证蓝与要求4/2聋4/2颜02334体内药们物分析2.标准系列抹溶液的浓吓度范围至少含5僚～8个浓亿度点(不凶包括零点木,即空白接)——可覆盖全部脊待测生物构样品中的姿药物浓度如：1聋、2、舌5、1男0、2致0、5珠0、1赛00(赌等比梯议度模式盏—比例愁常数约枯为2忧)若体内平希均达峰浓怪度为50霉，其1/糊20为2减.5设定最高振浓度为1尖00，最农低浓度为闯1(个执体差异)实际制备租时：50榴0、25得0、10狭0、50哥、20、递10…馒…第四章煎分岩析方法壤的建立意与验证第三节另分谦析方法蛛的验证喷与要求4/2担4/2疤02335体内药物诸分析3.标准系馒列模拟习生物样耻品的制党备空白生盖物基质姻(如血歼浆)—访—加入哨标准系极列溶液呜适量，骂涡旋混务匀为防止训在标准牙溶液加绒入及涡轮旋混合面时造成兄的损失——①先棚加入标准瓣溶液柴③②再加入贞空白生物坐基质③涡旋乘混匀牧①抬②第四章冤分析方铲法的建立监与验证第三节忌分析方谱法的验证薄与要求4/24划/202文336体内药抵物分析4.标准曲数线的绘盛制以待测药维物的检测商响应(如赔色谱峰面茶积或峰高眉)或与斯内标物质嫁的检测响春应的比值没(内标法薪)(因变狮量,y)对模拟剥血药浓度顿(自变想量,x)——求雄得回归喝方程(y＝a＋bx)及其相筝关系数()在一组散由至少围7个浓劲度(不盼包括零拔点)构汁成的标剧准曲线叔中，至多可风有2个鹊浓度点贼数据，塘可予剔套除。但应有确铃切原因，笛如：——样品痰处理有损仓失、色谱就图有问题钱，或——显芽著偏离惊标准曲模线〔该绑数据参戏与标准歌曲线回犯归后，勾计算QC样品或返浪算该点浓随度时显著鼓偏离其标鹅称浓度(烈配制浓度蜡)〕——其余应有至歇少5个滚浓度点括在标准示曲线上第四章贝分蓄析方法充的建立穿与验证第三节墨分阶析方法束的验证尽与要求4/2构4/2泽02337体内药约物分析5.加权最小宫二乘法最小二奏乘法——每个淋浓度点绝对误差(yi－yi’)赋厦予同等科的重要牲性标准曲共线上的奏高低浓废度相差蓬悬殊(寒范围达捏102)——低夕浓度区互的计算亭值相对荣误差过流大，难砍以满足友规定要咬求加权最小塑二乘法——回童归计算举时增加须一个权重因子(w)——各浓跃度的响应咱值与回归喇值的相对误离差平方亲和达到最再小式中，wi为标准苹曲线上书第i个哪浓度点恩的权重模因子第四章谈分析方替法的建立将与验证第三节宽分析方但法的验证服与要求4/2陡4/2纳02338体内药雨物分析1）回谢归方程歌(y=a怕+bx)参数的纤计算第四章罪分析方芦法的建立晨与验证第三节歌分华析方法垃的验证畏与要求4/2探4/2第02339体内药物树分析2）权掏重因子帮的选择加权——赋予域低浓度点庙以更大的滔权重在实际锋工作中哥的一般疤方法——当wi=1/(yi’)2时，则——而yi与xi成正比——所以越，令wi=1/乒(bxi)2=k/xi2(通常匀取wi=1/僵C2)当高浓度点测量值叠的准确本度下降过大——低浓告度点权重丢过大，降低低浓度粥点的权重，wi=k/xi第四章饭分析方味法的建立晶与验证第三节杨分般析方法阔的验证毅与要求4/24稳/202虽340体内药物箭分析标准曲线获的限度要求药代动凡力学或甘生物利枯用度研漫究——标准曲线庙至少包括在5个浓度(通常污为5～8个附浓度,不包括访零点)——最脸高浓度效应高于御达峰浓缴度(Cmax)；最杯低浓度蛾应低于Cmax的10%勺～5%，膛并应为方娘法的LOQ(非LOD)——回归方程塞的截距应川接近于零——相关系愁数要求≥0.9际9(色谱禁法)或≥钩0.98惯(生物学变方法)——若非线嘉性，可投分为高够低两个浓浓度区间(每个客区间不写少于5考个浓度闭)，分年别加权孕回归—辜—如1猾、2、赖5、1砖0、2馋0和1疲0、2提0、5订0、1抱00、拦200第四章喇分封析方法滨的建立被与验证第三节娱分听析方法抬的验证吐与要求4/24糠/202杜341体内药赔物分析三、准确津度方法准确桑度(ac魔cura抹cy)——系李指用该脱方法测得的躁生物样守品中待烧测药物泳的浓度厉与其真遵实浓度练的接近昏程度——应缠使用实飘际生物拴样品测只定，但箱实际生锄物样品舞的浓度刮是未知驾的所以速，通常妥使用模稳拟生物斩样品测恰定——一相般用相对回收富率(re池lat杰ive胁re朽cov魄ery究，RR)或相对误差(re挂lat乘ive寒er逗ror庸，RE)表示第四章享分摊析方法岸的建立度与验证第三节挑分扇析方法各的验证掉与要求4/2户4/2评02342体内药物去分析1.测定法取空白论生物基深质（如颠血浆）班数份，锻照标准比曲线项旋下方法遗操作，繁用标准础曲线计拼算在标准曲坏线范围内两制备质控香(qua胡lity勤con忽trol缸，QC)样品——高斑(接近奇上限)抓、中、犁低(接量近LOQ)3暂个浓度——每一浮浓度至少洗5个样本——与麦随行的只标准曲颂线同法摘测定、颜计算，作每个样川品分析禾测定1呆次第四章贞分析方圈法的建立足与验证第三节片分忍析方法指的验证田与要求4/24贯/202恒343体内药物略分析2.结果计常算与限斜度要求计算——测定伟值M(mea时sure康d)平均斯值与理论刺浓度(加斥入值)A(add财ed)比袄值相对回休收率相对误宅差限度要盟求——相对虽回收率应乓在85%头～115序%(LOQ附近80还%～12泛0%)——RE在±1稠5%遭(LOQ附近为±炮20%)第四章袋分析方跑法的建立绒与验证第三节驾分剩析方法占的验证环与要求4/2露4/2滩02344体内药物酱分析四、精的密度方法精遗密度(流pre裳cis禾ion渠)——系径指每次腔测定结眼果与多写次测定铜的平均披值的偏离程度——表滥示该分跳析方法仔的可重复性(re北pro揉duc溪ibi林lit馒y)——反养映分析轮方法的可操作性，是膨方法验虑证的基患本要点窗之一实际生市物样品潮的量有石限(如靠血浆，畅一般为撑0.5待～2m袭l)——使液用模拟御生物样温品测定第四章能分置析方法灰的建立膏与验证第三节瞧分析方蝴法的验证套与要求4/24臣/202邀345体内药物靠分析1.怕表示方滚法方法精蛛密度一尼般用标唯准偏差答(st薯and股ard颤de袋via这tio抱n，SD)或相对标准吓偏差(rel亏ativ缴est漂anda沸rdd炒evia魄tion乡丰，RSD)表示SD=RSD=投=——包展括批内嚼(wi逼thi横n-r赌un或薪int覆ra-查ass原ay)RSD筝—日内(配wit掠hin有-da矮y)和批间(豆betw其een-锋run或放inte件r-as尽say)RSD—日间(b锹etwe低en-d撞ay，d静ay-t纽奉o-da吊y)第四章苏分亩析方法究的建立年与验证第三节骨分析方身法的验证羡与要求4/24晴/202居346体内药物典分析2.禾测定法嫁——分别测脏定法(戒Ⅰ)照准确度柿项下方法狗，取空白厨生物基质诸(如血浆史)数份，假分别在同朗一批内和脸不同批间的制备高、邻中、低层3个浓度骨的QC样品，击并分析珠测定批内RSD——每艰一浓度凳5～6山个样品佣，每个讯样品测录定1次霸，用随加行标准去曲线分依别计算裂3个浓蒜度及每缴1浓度勺的RSD批间RSD——每1例分析批内绕每一浓度化制备1个蛮样品，每络个样品测愿定1次；暮用随行标民准曲线计悔算3个浓净度(每一双浓度5～阵6个分析耻批数据)失的RSD第四章反分析方席法的建立蜻与验证第三节虚分析方坑法的验证姓与要求4/24像/202狭347体内药康物分析2.测墓定法——连续测定贷法(Ⅱ)若实际样来品测定所驰用的分析背批次少于酒5批，也滔可进行3雹个批次的莫连续分析管(每1浓邪度的每1迷批次为5诊～6个样慰本)——方差分捷析法批间RSD=批内RSD==第四章该分析方岛法的建立懒与验证第三节晚分析方少法的验证纳与要求4/2驰4/2龟02348体内药怎物分析3.限度要求在药代隔动力学欲和生物谋利用度忍研究中对g/m盆l级水盼平的RSD一般应≤乎10%ng/敌ml级功水平的RSD一般应忌≤15访%在LOQ附近RSD应≤2挨0%。第四章禁分析方揪法的建立之与验证第三节朽分别析方法屡的验证已与要求4/2介4/2挺02349体内药物骑分析五、定挎量限方法定领量限(埋lim阔it软of刃qua蹄nti席tat科ion展，LOQ)——系指定在保证具扩有一定可仁靠性(准润确度与精格密度符合趴要求)的引前提下，序能测定出雅生物样品抹中药物的汽最低浓度——又戏称为方哈法灵敏势度(s甩ens亲iti盘vit色y)——标准钱曲线上的震最低浓度丘点(最低顽浓度点≥LOQ)要求——应根能满足脖测定3启～5个俱消除半棕衰期后督生物样哪品中的蓄药物浓分度——准确证度在80膛%～12索0%(或RE在±20供%的范围改内)——RSD＜20%第四章搞分款析方法诉的建立绵与验证第三节圣分赛析方法抓的验证娘与要求4/24毫/202膨350体内药键物分析六、稳糕定性与言质量控叹制稳定性—饶—包括方届法稳定性艳和样品稳麻定性方法稳定妹性——方鸡法的耐君用性样品稳定冻性——生颤物样品补的存放棉条件和淋时间、醒冻-融湾循环测定法——QC样品穿拦插于实机际样品傍测定全母过程——模拟践(或实际高)生物样剃品及其预蚂处理后的仗待测溶液梯进行考察要求——准控确度8鲜5%～蜻115剖%(RE在±15切%范围内亏)，RSD＜15雅%第四章垄分析方卖法的建立验与验证第三节拾分析方凝法的验证更与要求4/2毛4/2棕02351体内药物列分析七、萃勿取回收及率生物样凝品的预帖处理方溜法——重嫁点考虑方法准控确度(或相对回收先率)，操作余简便、快烤速——萃取腔回收率(宁绝对回收己率，ab元solu望ter瓣ecov愉ery)押，≥70能%萃取回踏收率与但相对回已收率的讨意义不财同萃取回收救率——考湿察生物样券品预处理拣过程造成辣的药物的言程度损失相对回收碎率——采属用标准曲露线可准确榴计算生物骨样品中药骄物浓度第四章窜分析方灭法的建立仿与验证第三节造分诵析方法承的验证圾与要求4/24师/202目352体内药物言分析1.测定法取空白沉生物基吴质(如鞋血浆)赴，照准涛确度项揭下方法柿，制备锅高、中叉、低3巩个浓度温的QC样品(肾每一浓日度至少霸5个样猛品)，扬每个样蜜品分析匆测定1萍次另取等例量的相意同3个壶浓度的形标准溶供液，用录溶解模狗拟生物跑样品经尽提取处翅理后的助残渣的博溶剂稀蛛释至同允体积，石同法测痕定AT——经萃止取后的QC样品的栋检测信淹号或比岩值(内瓣标法)AS——未坛经萃取抖的标准借溶液的峡检测信纯号或比若值(内穷标法)第四章滋分析方丛法的建立暮与验证第三节识分析方振法的验证吨与要求4/24尖/202刷353体内药候物分析2.限度要边求萃取回芽收率一例般应≥当50%高、中浓绞度的RSD应≤15买%低浓度贵的RSD应≤20旧%。第四章敏分乡丰析方法挎的建立招与验证第三节扑分析方险法的验证国与要求4/24蓄/202兵354体内药物婚分析第四节体内药物朱分析方法告应用伐示例第三代兵喹诺酮签类广谱逃抗菌药盐酸环丙楼沙星片人超体生物等眨效性研究一、文献手调研性质——在水中溶总解，在甲低醇中微溶效，在乙醇边中极微溶灭解，在氯会仿中几乎往不溶，在闸氢氧化钠逆试液中易央溶；环丙丛沙星游离裤体在水中岸不溶，在谊乙醇、二稿氯甲烷中猛极微溶解求，在稀醋图酸中溶解五。第四章塑分析方松法的建立袍与验证4/24隐/202把355体内药纤物分析药动学参锈数吸收过程——空守腹口服清后吸收柔迅速、钞人体生败物利用通度约为臂49%获～70年%Cmax——口裹服50犯0mg芳后平均Cmax为2.4哥～2.6晨mg/LTmax——1夺～2hT1/2——血中T1/2约为4h谣，肾功能趴减退时稍亮有延长至诱6h蛋白结作合率——2宪0%～阁40%代谢——口济服给药蛋24h方内，4嚼0%～梁50%垂原形、凭15%庭代谢物温经肾排肾出第四章怀分析方浮法的建立朴与验证第三节逝分色析方法帆的验证音与要求4/24须/202易356体内药声物分析体内分芳析方法RP-烤HPL塑C色谱柱—托—ODS璃色谱柱流动相怨——甲枣醇(乙匹腈)-迁磷酸(速枸橼酸咽)缓冲厕液(三榆乙胺调怖节pH蹄2.3讽～3.登5)，导或离子对衬色谱:溴姻化十六璃烷基三啦甲基铵描(氢氧既化四丁宁基铵)检测——益紫外或荧付光检测生物样白品预处桥理蛋白沉急淀法—服—甲醇盈、乙腈佛或高氯赠酸沉淀磨蛋白后脂直接进偶样溶剂萃杠取法—百—二氯养甲烷-返异丙醇仍、氯仿饮-异丙写醇混合帐溶剂蛋白沉肿淀-溶贩剂萃取锻——乙军腈沉淀铁蛋白后倾二氯甲搭烷-异愈丙醇提斩取第四章婶分析方就法的建立缴与验证第三节妙分析方察法的验证暮与要求4/2社4/2艇02357体内药妹物分析二、分来析方法罢设计1．分析樱方法血浆蛋白泰结合率低华(20%锯～40%帜)、以原准形从肾排土泄生物等队效性研从究——赌测定血险浆中环辞丙沙星表原形药复物的浓据度-时株间曲线健。初步拟竖定：采用R伶P-HP掉LC法2．检陪测方法紫外——先灵敏度＜筝1ng，泳若取血浆翁0.5m坐l，采用枝3倍量乙请腈沉淀蛋陷白，取上倦清液10搬0l进样，良则要求血抓浆中环丙贱沙星浓度搂在50n慎g/ml狼以上，当Cmax在2g/m够l以上界(口服站500俭mg)裳时基本可翁满足生物等效公性研究要怕求荧光——请灵敏度＜递0.1n职g，能满足本试验要茂求第四章坦分表析方法马的建立那与验证第三节诵分唱析方法咽的验证类与要求4/24棒/202桥358体内药物客分析二、分析烤方法设计近（续）3．样压品制备甚方法初步拟关定——盗采用简休便、快川速的乙锅腈沉淀谅蛋白后为取上清斯液直接棋进样分肺析预试—尸—含7贱5%乙旧腈的提性取液1袋00l进样后辈，色谱峰篮理论板数样、对称性幼下降(前冲沿峰)，继进而导致赵检测灵敏搅度降低(影峰高降低揭)经进一涝步试验碗，确定为跃：血浆0.总5ml→寸乙腈1m颈l沉淀蛋律白→二氯有甲烷-异蚀丙醇(9偏5:5)5m佳l萃取→毫60℃呀氮气流吹抄干→流动直相200l溶解→规20l进样灵敏度可玻达2ng哪/ml(圆血浆浓度务)，符合胁要求(Cmax＞2g/波ml)第四章透分妹析方法系的建立贸与验证第三节姐分析方削法的验证悼与要求4/2跌4/2么02359体内药帐物分析三、实验飞方案1．给药爹方案20名受夜试者随机得分为两组怎，每组1称0人第1次试疑验——第望一组口服斤受试制剂朴(相当于崇环丙沙星盈500m唇g)，第概二组口服迫相同剂量吊的参比制突剂第2次赛试验—读—第1信次服药豆后第7妨天开始机，两组羽交换给眼药第四章朵分析方叨法的建立稿与验证第三节博分析方腥法的验证们与要求4/2除4/2铺02360体内药偶物分析三、实验连方案（续宝）2．血殿样的采嚼集与处惰理分别口意服给药捆前和给汤药后0群.25犁、0.俯5、1.0、凉1.5(tmax)、2.裂0、3.纸0、4格.0、浓6.0摩、8.甚0、1姿2.0锹和24.0貌(5~7童个t1/2)小时由肘正中甘静脉取血窑4m答l立即移晓入经肝斥素处理皂的离心哪试管中喇，静置浴5分钟扯后，离暖心15董分钟(条300头0rp页m)，抱分离血挣浆-20℃客冰箱中保种存待测第四章情分析方沟法的建立淹与验证第三节烂分逃析方法顽的验证般与要求4/2资4/2泻02361体内药叨物分析三、实吉验方案项（续）3．血样奸分析法色谱条消件——高驰效液相育色谱仪清(包括东LC-象10A薪Tvp泵，R马F-5裁30荧武光检测驻器)；阔色谱柱纷为Kr磨oma榆sil擦OD秋S-A聚P(2长00m旧m×4箱.6天mm，晓5m)——流仿动相为神乙腈-亲0.0回25m达ol/边L磷酸址溶液(草86:14)，病流速1.夺0ml/职min——检乱测波长混为ex=27惹7nm花，em=44更5nm——柱温客为40℃姑。第四章蚁分析方阔法的建立痰与验证第三节银分析方胀法的验证朗与要求4/24葵/202柏362体内药纤物分析三、实拉验方案斥（续）3．血样尊分析法血浆样品沃的预处理取血浆0需.5ml肌，加内标浩溶液(1走0g/m萍l诺氟乘沙星甲托醇溶液哈）50l、乙沈腈1.皮0ml减，涡旋秃混合3概0s，优离心5须min浓，取上矩清液1让ml，绕加二氯戴甲烷-想异丙醇户(95:5)混合让溶剂5m株l，涡旋覆振荡1m羊in，离隆心5mi坏n，弃去为上层水相客，吸取下键层有机相酱，60℃浑下氮气流拥吹干，残亭渣加流动蛙相200l，涡旋掩溶解30术s，离心结5min卡，取上清寒液20l进样第四章铅分伙析方法如的建立关与验证第三节党分析方诞法的验证躁与要求4/2溪4/2售02363体内药邀物分析四、分析津方法验证1．方低法特异蚁性环丙沙星迁峰tR=12.沙4min底，诺氟沙摘星(内标炭物质)tR=10.伏9min患，各峰均判获得完全挥分离，内踪蝶源性物质晋峰(与空论白血浆样顾品一致)tR=8.劣6mi朽n对测掠定无干脏扰志愿者用药后的乞血浆样败品色谱图腹中环丙川沙星与俊内标物户质峰与模拟血浆划样品中环丙沙植星与内标违物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不孝认为代戒谢物有气干扰第四章孤分工析方法唱的建立什与验证第三节撒分矿析方法感的验证匹与要求4/24顾/202朋364体内药预物分析四、分析财方法验证际(续)2．标仙准曲线标准系谋列溶液木——取瓣盐酸环墨丙沙星盼，加水往制成1淹、2、冬5、1敢0、2炸0和5贪0g/m弊l的标医准系列盛溶液，萝冰箱保逆存标准系列没模拟血浆只样品——同取空白血徒浆0.5催ml，加萝环丙沙星都标准系列归溶液各5宗0l，配制看成相当于宣浓度为0饲.1，0森.2、0挤.5、1各.0、2巾.0、5匆.0g/ml覆的QC样协品，冰冻杜(-20兄℃)测定法—流—取QC咽样品，照掀“血浆样拘品的预处锅理”项下主方法操作欢，以环丙荷沙星浓度C为横坐标顽，环丙沙悼星与内标愚物质的峰务面积比值Y为纵坐铅标，用抱加权最采小二乘泳法经E注xce动l运算虑，求得割的直线剃回归方倦程为：Y=1.3差3·C-0.0技2583姨，R2=0.9尺951(C=0.1～权5.0g/ml厉)第四章挎分析方宪法的建立巴与验证第三节萍分雨析方法咐的验证遍与要求4/2芹4/2捡02365体内药苹物分析四、分翅析方法技验证(熔续)3．方负法精密呆度与准王确度QC样品瓣——燥浓度为借0.1、镰0.5联和2.裕0g/m烛l分析批色次——上3批，宵每批圆5样眠品测得浓宁度——堤0.0剪988贫、0.粱453葱7和捏2.宜128g/ml准确度RE(%)翠—煤—-托1.2至%、-稿9.3筹%和激6.程4%精密度批内(%赌)——祸6.7%后、4.6述%和静3.9%批间(%菌)——邻8.9%枪、9.6泰%和还12.3装%第四章千分析方忘法的建立司与验证第三节赴分删析方法辟的验证城与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.34/2脑4/2沾02366体内药叫物分析四、分析阀方法验证侮(续)4．方法洗定量限受试制婚剂和参顷比制剂满的Cmax分别为——3纯.20馅20.496蹲和3.暂3000.730g/ml方法的LOQ为0.1g/m亦l＜0.1倘6g/m互l(Cmax的1/2拐0)——准榆确度和厨精密度陵均符合姻要求：RE为-1.喜2%日内RSD为6劫.7%日间RSD为8.指9%第四章砖分析方街法的建立惊与验证第三节汉分弄析方法漂的验证花与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.34/2肺4/2货02367体内药贪物分析四、分析翅方法验证钢(续)第四章丛分系析方法佩的建立陡与验证第三节胡分析方与法的验证墓与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.