中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座

中药判定创新方法体系建立与推广

DNAbarcodingsystemforherbalmaterials

陈士林ShilinChen中国中医科学院中药研究所中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第1页中药判定技术瓶颈

一万余种中药材物种判定品种混乱传统四大判定方法体系局限路在何方？基原判定形态判定显微判定理化判定中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第2页DNA条形码中药判定领域变革与突破经典中药判定方法难以满足当代需求判定方法缺失造成严重安全性事件

--关木通误当木通服用，造成急性肾功效衰竭（马兜铃酸肾病事件）

--土三七误当三七服用，造成严重肝毒性Hoangetal.ScienceTranslationalMedicine,,5:197ra102.NortierJL,MartinezMCM,SchmeiserHH,etal.NewEnglandJournalofMedicine,,342(23):1686-1692.关木通baidu百科木通中药材天地网中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第3页DNAbarcodingcanachievearapidandaccurateidentificationforherbsApowerfultoolforidentifyingmedicinalplantsandtraditionalChinesemedicinalmaterialsAbruscantoniensis

Abrusprecatorius

MedicinalplantsChineseherbalmedicinesDNAbarcodingtechnologyusesashortandstandardizedgeneregiontoidentifyspeciesOnesequenceOnespecies中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第4页课题组首次提出并验证ITS2条形码，引发国内外广泛关注

国际期刊PLoSONE关注药用植物DNA条形码。该文提出ITS2序列为药用植物通用条形码序列，为陆地植物DNA条形码序列筛选提出了新视角，由此引发同行关注和讨论。被德国专业网站选为近25年来在ITS2领域最受关注16篇文章之一http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/该文发表后3年引文288次中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第5页首次验证ITS2为药用植物判定通用条形码经过研究比较psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2和

ITS等七个候选DNA条形码，发觉ITS2是最正确条形码序列ITS2长度约230bp，易于扩增和测序，物种判定能力强，适合中药材等存在DNA降解材料判定人参、西洋参、羌活、宽叶羌活DNA条形码判定方法正在纳入国家药典中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第6页

Relativedistributionofinter-specificdivergencebetweencongenericspeciesandintra-specificvariationforfourloci.Thetwobarsineachboxrepresentinter-specific(above)andintra-specific(below)geneticdistances.IdentificationofthefamilyRosaceaeW+W-RelativeRanks,n,PvalueResultITS2matKW+=703,W-=0,n=37,P≤1.139×10-7ITS2>matKITS2rbcLW+=703,W-=0,n=37,P≤1.137×10-7ITS2>rbcLITS2rpoC1W+=703,W-=0,n=37,P≤1.133×10-7ITS2>rpoC1matKrbcLW+=620,W-=46,n=36,P≤6.479×10-6matK>rbcLmatKrpoC1W+=655,W-=11,n=36,P≤4.174×10-7matK>rpoC1rbcLrpoC1W+=359,W-=106,n=30,P≤0.009rbcL>rpoC1Wilcoxonsigned-ranktestsofinter-specificdivergenceamongloci.ITS2andrbcL,matK,rpoC1werecompared.For54samplesfrom43speciesin19diversegenera,thesuccessfulidentificationratewithITS2was100%,followedbymatK(94%)andrbcL(65%).

For1410samplesfrom893speciesin96genera

No.ofgenera(≥2species):47(1351samples)

No.ofspecies(≥2samples):297(814samples)

IdentificationratewithITS2was100%and78%at

genusandspecieslevel,respectively.XPang,ShilinChen*.Cladistics,2011,27中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第7页ComparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatITSshouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants

ChinaPlantBOLGroup,LiDezhuetal.,PNAS,WethereforeproposethatITS/ITS2shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants.(提议ITS/ITS2应成为种子植物关键条形码)IncaseswhereitisdifficulttoamplifyanddirectlysequenceITSinitsentirety,justusingITS2isausefulback-upasitiseasiertoamplifyandsequencethissubsetofthemarker.(ITS难以扩增和测序时，ITS2能够有效地填补该缺点)中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第8页

创建ITS2为主体条形码中草药判定体系研究一万余份药材样本（包括数千个基原物种）70余篇相关文章发表于Cladistics、PLoSONE、PNAS、BMCEvolBiol、中国科学等杂志出版《中药DNA条形码分子判定》人民卫生出版社起草中国药典中药材DNA条形码分子判定指导标准，已获准纳入国家药典建立中药DNA条形码分子判定标准流程中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第9页冬虫夏草混伪品及近缘种人造伪品：滇紫菀冬虫夏草及其混伪品/近缘种背景：分布范围狭窄，生态环境脆弱，资源蕴藏量有限（产量每年80-100吨）；

市场产不足销，价格已超黄金(Guo,)

混伪品泛滥，如古尼虫草，蛹虫草，人造伪品滇紫菀等

样品：冬虫夏草与13种混伪品及近缘种，冬虫夏草采自四川、青海、西藏等主产区

185

条ITS/ITS2序列

(冬虫夏草样品53份，伪品45份，GenBank序列87条)A：正品：冬虫夏草B：伪品：亚香棒虫草/古尼虫草C：人造伪品：滇紫菀D：伪品凉山虫草E：伪品：蝉花F：伪品：下垂虫草G：伪品：Cordycepsrobertsii（新西兰）结果：基于BLAST/DISTANCE判定效率：100%基于NJtree判定结果：全部冬虫夏草序列单独聚为一支，

并能与全部混伪品及近缘种区分开XiangL,ChenSL,etal.FEMSmicrobiologyletters,,347(2):156-162.DNA条形码判定冬虫夏草及其伪品中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第10页《中国药典》中药材DNA条形码分子判定指导标准中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第11页

Morphologicalcharacteristicsofthepowder,decoctionpieces,seed,seedling,andfibreamongtheP.ginseng,P.quinquefolius,Pnotoginsenganditscloselyrelatedspeciesaresimilar.Itisdifficulttoidentifysomanydifferentpanaxspeciesandginsengproduceinmedicinalusesbytraditionalclassificationmethods.UsingDNAbarcodetoidentifypanaxmedicinalspecies人参类及其混伪品判定中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第12页13

15101520253035404550SN01:p.ginseng;SN03:p.quinquefolius显示人参、西洋参ITS2序列SNPs位点信息。Position32and43为区分人参和西洋参SNPs位点为验证该方法准确性，我们下载了GenBank全部些人参、西洋参ITS2序列，表明两个SNPs位点稳定存在样品起源：采集了主产区吉林，辽宁，黑龙江，北京，山东,加拿大及上海和香港药市人参西洋参样品共计72份应用ITS2序列两个SNPs能够快速准确判他人参西洋参，所得组合为C-T，则确定为人参，所得组合为T-C，则确定为西洋参ITS2sequenceposition1-50ofp.ginsengandp.quinquefolius

方法结果结论基于ITS2条形码判定人参和西洋参Gene,,530(1):39-43.AFastSNPIdentificationofMedicinalPanaxSpeciesBasedonDNABarcodingAnalysis,

中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第13页14金银花药材及其混伪品ITS2条形码判定金银花（忍冬）山银花（红腺忍冬）山银花（黄褐毛忍冬）山银花（灰毡毛忍冬）研究对象：包含24份金银花药材。M:marker1、26:阴性对照(CK)2-25:金银花27-47：混伪品DNA提取：取金银花药材约25mg，利用植物基因组DNA提取试剂盒(TiangenBiotechCo.,China)提取总DNA。ITS2序列PCR扩增程序及电泳图94℃变性5min94℃变性30sec58℃退火30sec72℃延伸45sec72℃延伸10min40个循环BLAST判定中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第14页

IdentificationofCortexHerbsSunZY,ChenSL*.JNatMed..Theidentificationefficiencyof51samplesbelongingto19kindsof

cortexherbsinChinesePharmacopoeia

examinedwas100%usingITS2sequenceasDNAbarcode.ApplytheITS2barcodetoauthenticate

medicinalmaterials皮类药材条形码判定中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第15页条羌N.franchetii大头羌N.franchetii蚕羌N.incisumPhylogenetictreeconstructedwiththeITS/ITS2sequencesadulterantsITSITS231medicinalmaterialssamplesStabilityandAccuracyoftheIdentificationusingITS/ITS2barcodes

(Notopterygii)羌活药材ITS/ITS2条形码判定及其稳定性与准确性研究TheNJtreesshowedthatQianghuoanditsadulterantscanbeeasilydifferentiatedaccordingtotheirmonophyly..ITSITS2HaplotypeVariablesitesHaplotypeVariablesitesN.incisum4433N.franchetii61045XinTChenS*,etal.ActaPharmSin.,8中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第16页UseofthepotentialDNAbarcodeITS2toidentifyherbalmaterials全草类DNA条形码判定

TheITS2barcodecoulddistinguishsuccessfullyallthe34herbsfromtheir111adulterants.Figure1.Thepresence/absenceofbarcodegapsbetweenherbsandtheiradulterants.

PangXH,ChenSL*etal.JNatMed.中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第17页建立中药材DNA条形码判定系统网站中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第18页

DNAbarcodesystemshowsstrongabilitiesinidentifyingherbcrypticspeciesBLASTPROCESS打开网址，进入中药材DNA条形码判定系统主页点击物种判定，选择植物类药材判定（ITS2/ITS）进入右图界面。中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第19页在空白处粘贴入需要校正确序列（Query）点击左下角提交比对序列相同性信息100.0%为人参，说明该序列判定结果为人参Quick-and-easyDNAidentificationofherbsisunderway中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第20页华润三九中药材DNA条形码判定专用软件中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第21页2023/4/24中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第22页

七叶皂苷注射剂娑罗子药材基原植物为七叶树Aesculus

chinensis、浙江七叶树Aesculus

chinensisvar.chekiangensis和天师栗Aesculus

wilsonii娑罗子药材DNA条形码判定1.材料

七叶树属10个物种42份样本采自云南、四川、陕西、湖北、浙江和北京各个分布区域结论七叶树属候列扩增效率与测序成功率均为100%，而且物种判定效率最高，为95.4%，更适合用于七叶树属判定分析。psbA-trnH序列种间差异最大，在区分物种上含有优势。基于psbA-trnH序列构建NJ树，可准确判别其各个基原物种。七叶树属植物psbA-trnH序列比对变异位点图正品中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第23页柴胡Chaihu正品：为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.、狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.干燥根。近缘种：同属植物丽江柴胡B.rockii，小叶黑柴胡B.smithiivar.parvifolium，抱茎柴胡B.longicaulevar.amplexicaule，细茎有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum和窄竹叶柴胡B.marginatumvar.stenophyllum。（三）柴胡与其近缘种NJ树图所表示：柴胡正品基原柴胡与狭叶柴胡均独立聚为一支，与其混伪品能够区分开。结果表明：基于ITS2序列能很好区分柴胡及其近缘种（一）柴胡及其及其近缘物种ITS2序列二级结构：（二）柴胡与其混伪品ITS2序列间存在较多变异位点柴胡不一样基原ITS2条形码consensus序列柴胡ITS2序列峰图中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第24页惯用中药材进行了DNA条形码研究课题组已经进行DNA条形码研究惯用中药材包含：人参，西洋参，三七，大黄，石斛，重楼，金银花，丹参，天南星，红豆蔻，肉苁蓉，京大戟，麻黄，高良姜，何首乌，吴茱萸，连翘，甘草，玉竹，冬虫夏草，羌活等中药鉴定创新方法体系的建立和推广专家讲座第25页

PublishedpapersonDNAbarcodeCladistics,,27:BMCEvol.Biol.,,10:324

PLoSONE,,5:e13102.ChinaPlantBOLGroup.PNAS,,108(49)FEMSMicrobiologyLetters,

PLoSONE,,7(5):e35146.Jingyu