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文档简介
Compensation,Controls,
andDataCollection23-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第1页CompensationGoalRemovespilloversignalssothatsubpopulationMFIsagree223-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第2页DoesCompensationIncreaseDataSpread?UncompensatedCompensatedCompensationcorrectstheMFI,butcannotremoveallofthevariationincreaseintroducedbyspillover.However,undernormalconditionsthespreadinafluorescencemeasurementwithspilloverwilldecreasewhencompensationisapplied.Whenviewingdataonlogandbiexponentialplots,dataspreadappearstoincreasewhencompensationisapplied—thisisoftenavisualartifactduetothenon-linearscalingoftheplot.Spread323-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第3页CytometerSettingsWorkflowObtainCS&TsettingsApplyapplicationsettingsVerifysettingswithsampleCalculatecompensation423-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第4页CompensationforTandemDyesCompensationfortandemdyeconjugatescanvary,evenbetweentwoexperimentswiththesameantibody.Tandemdyesrequirecompensationthatis:lot-specificexperiment-specificlabel-specific523-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第5页CompensationRules—Part1Thefluorescenceemissionspectrum
ofcompensationcontrolsmustmatch
theexperimentreagents—thisis
especiallycriticalwithtandemreagents.Compensationcontrolnegativeandpositive
populationsmustbefromthesamecellorparticletype. Example:don’tuseaCD3–monocytenegativepopulationwithaCD3+lymphocytepositivepopulation.623-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第6页CompensationRules—Part2Compensationcontrolsmustbebrightenoughtoobtaingoodseparationbetweenthepositiveandnegativepopulations.Compensationcontrolsmustplacethepositivepopulationinthelinearrange.Whenusingcellsforcompensation
controls,increasethenumberof
eventstoatleast10,000pertube.WheneverMFItargetvalueschange,
reruncompensation.723-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第7页BDCompBeadsUsethesameantibodiesasintheexperimentalsamples.Createbrightanduniformpositivefluorescencepeaks.Avoidusinglimitedsample.Beadsarecoatedwithanti-mousekappa*.*BDCompBeadsarealsoavailablecoatedwithanti-ratkappaandanti-hamsterkappa.CompBeadAconvenientway
tocreateaccurate
single-colorcompensationcontrols823-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第8页UnstainedCompensationControlTubeWhenshouldIuseanunstainedcompensationcontroltube?InBDFACSDivasoftware:
Ifusingaseparateunstainedcontrol,selectthe
Includeseparateunstainedcontroltube/well
checkbox.Ifnotusingaseparateunstainedcontrol,clearthecheckboxandforeachparameterincludeaP3gateforthenegativepopulation.923-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第9页CompensationQCBiexponentialdisplayrevealscompensationproblems.OverCorrectBiexponential1023-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第10页CompensationDiscussionPointsHowoften?HowtoQCandadjustsettings?Postacquisition?Shouldcompensationcontrolsbetreatedthesameasexperimentalsamples?
(example:fixedandpermeabilized)1123-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第11页Controls1223-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第12页ChooseAppropriateControlsWhatWhyCytometersetupcontrols
BDCompBeadsEnsureconsistentsetupandcompensationGatingcontrols
FMO
Isotype
CombinedObtainreliablegatesforproblemmarkersBiologicalcontrols
Unstimulatedsamples
HealthydonorsMakeappropriatebiologicalcomparisonsandconclusions1323-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第13页GatingControlsFluorescence-Minus-One(FMO)controlIncludesalltestantibodiesexcepttheoneofinterest.Doesn’ttakebackgroundstainingintoaccount.Usefulinsettinggatesandconfirmingspilloverproblems.IsotypecontrolNon-specificantibodyofsameisotypeasthetestantibody.Doesn’ttakespilloverintoaccount.CombinedcontrolAlltestantibodiesexcepttheoneofinterest,whichisreplacedbyanisotypecontrol.Mightnotaccuratelyrepresentthebackgroundstainingofthetestantibody.1423-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第14页FMOExampleGatedonlymphs,CD3+CD4-Gatedonlymphs,CD3+CD4+Full9-colorcocktailFMOAmCyan1523-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第15页ComparisonofGatingControls1623-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第16页DataCollection1723-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第17页125,000lymphocytescollected20,000lymphocytes
collectedNumberofEventsvsMeasurementPrecisionCD4+TcellsCD8+Tcells14events=0.14%73events=0.34%8events=0.23%51events=0.09%1823-13536-00Rev.01多色流式细胞FACS调补偿与圈门专家讲座第18页StatisticalSignificanceofResultsDeterminingtheNumberofEventstoCollect
NumberofRelevantEventstoCollect
%Background(False+)
Lowest%Positive
90%power,p<0.05
99%power,p<0.005
0.01
0.02
260,000720,0000.01
0.05
32,00090,0000.01
12,00032,0000.02
0.05
67,000190,0000.02
16,00045,0000.03
0.05
170,000480,0000.03
0.1
23,00063,0000.04
0.1
33,00093,0000.05
0.1
52,000140,0000.06
0.1
86,000240,0000.07
0.1
160,00
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