生化课件 06第6章蛋白质的分离纯化

Chapter6PurificationandIdentification

ofProteins分离纯化蛋白质的意义Significanceofpurificationofprotein

蛋白质的纯化比起DNA克隆和操作来更具有艺术性，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因为它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的理化性质，而每一种蛋白质则有它自已的氨基酸序列决定物理化学性质（因为它具有执行众多生物学功能的用途）生化分离技术separationtechnique生化检测技术detectiontechnique蛋白质分离纯化的一般程序

GeneralProcedureofPurification(1)选择一种目的蛋白(interestprotein)含量丰富(abundant)、稳定性(stability)好的样品材料(material)。(2)将蛋白质从样品(sample)中抽提(extract)出来。(3)确定分离纯化的方法method，使粗品的纯度达到预定要求。(4)建立灵敏（sensitive）、特异、精确的（exact）检测手段testmethods，分步(step-by-step)测定(determine)蛋白质的含量(content)，检验蛋白质纯度(purity)。(5)在操作、分析过程中注意(attention)保护蛋白质的稳定性，防止变性(topreventdenaturation)。一般程序的选择策略是：选择不同机制的分离单元组成一套工艺，将含量多的杂质先分离去除，以尽快缩小样本体积，提高产物浓度。尽早采用高效分离手段，将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。蛋白质分离纯化的一般原则前处理（pretreatment）粗分级分离(Roughfractionation)细分级分离(finefractionation)前处理(pre-processing)样品选择的原则(principle)：有效成分(effectivecomponent)含量高、稳定性好、来源丰富、保持新鲜，实验条件恒定、取材工艺(craft)简单，有综合利用价值(worth)等。在实践过程中则需抓住主要矛盾、全面考虑、综合权衡。

前处理(pre-processing)

：有些样品需冰冻(frozen)保存;有些样品需去掉(abscise)结缔组织(connectivetissue);有些样品需去掉脂肪组织(fattytissue)。根据不同组织选择适当方法将组织或细胞破碎。

粗分级分离(Roughfractionation)

把蛋白质与杂蛋白、核酸、多糖分开方法：盐析、等电点、有机溶剂体积大的样品采用：超滤、凝胶过滤、冻真空干燥、聚乙二醇细分级分离(finefractionation)

凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析区带电泳、等电聚焦结晶依分离现象或仪器设备分类生化分离技术沉淀分离技术precipitationseparation膜分离技术membraneseparation层析分离技术chromatographicseparation电泳分离技术electrophoreticseparation离心分离技术centrifugalseparation萃取分离技术extractionseparation根据蛋白质在溶液中的性质来分类分子大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的生物学亲和力一、提取与沉淀分离技术extractionandprecipitationseparation细胞破碎celldisruption提取extraction沉淀分离precipitationseparation机械法mechanicalmethod物理法physicalmethod化学法Chemicalmethod酶法Enzymicmethod

细胞破碎机械法mechanicalmethod通过机械运动所产生的剪力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法分为捣碎法(comminute)；研磨法(trituration)；匀浆法(homogenate)物理法physicalmethod

通过温度(temperature)、压力(pressur)、声波(soundwave)等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法分为温度差(temperaturehead)破碎法；压力差deliveryhead破碎法；超声波破ultrasonicwave碎法化学法chemicalmethod通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的主法所用化学试剂(chemicalagents)：甲苯(methylbenzene)、丙酮acetone、丁醇(butanol)、氯仿(chloroform)、吐温(Twain)酶促破碎法Enzymicmethod

通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到破碎细胞目的的方法溶菌酶lysozyme、葡聚糖酶glucanase、纤维素酶cellulase抽提(Extraction)：是指在一定的条件下，用适当的溶剂（solvent）（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂中的过程。溶液应具备的条件是：对有效成分溶解度大、破坏性小，对杂质不溶解或溶解度很小，来源广泛、价格低廉、操作安全等。提取方法：盐溶液(saltsolution)提取；酸溶液(acidsolution)提取；碱溶液(basesolution)提取；有机溶剂(organicsolvent)提取影响提取的因素(factorsofimpactingextraction)1.溶解度solubility：水溶性物质；脂溶性物质2.扩散速度diffusionvelocity3.温度temperature4.pH值

蛋白质的分离纯化方法沉淀分离precipitationseparation

沉淀分离：是通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的技术过程。分类

盐析沉淀法(saltprecipitation)；等电点沉淀法(isoelectricprecipitation)；有机溶剂沉淀法(organicsolventprecipitation)；金属盐沉淀法；选择性变性沉淀法(selectivitydenaturationprecipitation)盐析法(saltfractionation;Saltingout)在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶(Saltingin)。但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析(Saltingout)。这是因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。用于盐析的中性盐通常有硫酸铵(AmmoniumSulfate)、硫酸钠(sodiumsulfate)和硫酸镁(MagnesiumSulfate)等，而以硫酸铵为最佳，它在水中溶解度大而温度系数小(在25℃时，溶解度为767g/L；在0℃时，溶解度为697g/L)，分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度可适当地将蛋白质分开。添加饱和硫酸铵溶液，公式如下：式中，V为需加入饱和硫酸铵的体积（ml）

V0为原来溶液的体积（ml）

S2为需达到的硫酸铵饱和度(saturation)S1为原来溶液的硫酸铵饱和度固体硫酸铵直接加入到原蛋白质溶液中，计算方法式中，W为将1升S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加入的固体硫酸铵的重量（g）

A、B为常数，与温度有关，如℃时，A为0.27，B为707，20℃时，A为0.29，B为756盐析时的注意事项announcements在盐析过程中，注意所添加硫酸铵(AmmoniumSulfate)的纯度purity同一溶液中欲分离几种蛋白质，可采用分段(segmenting)盐析法(saltfractionation)盐析和等电点沉淀相配合盐析酶制剂(enzymepreparation)时，注意温度蛋白质浓度(concentration)应适度appropriate等电点沉淀法(isoelectricprecipitation)proton酸是质子（H+）供体（donor），碱是质子的受体(acceptor)有机溶剂沉淀法(Organicsolventsprecipitation)

有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低，溶液介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集；有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。介电常数又叫介质常数，介电系数或电容率，它是表示绝缘能力特性的一个系数，以字母ε表示，单位为法/米

附常见溶剂的介电常数

H2O(水)78.5

HCOOH(甲酸)58.5

HCON(CH3)2(N,N-二甲基甲酰胺)36.7

CH3OH(甲醇)32.7

C2H5OH(乙醇)24.5

CH3COCH3(丙酮)20.7

n-C6H13OH（正己醇）13.3

CH3COOH(乙酸或醋酸)6.15

C6H6(苯)2.28

CCl4(四氯化碳)2.24

n-C6H14（正己烷）1.88

复合沉淀法

在溶液中加入某些物质使它与蛋白质等形成复合物而沉淀下来，从而达到分离的方法常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇聚、丙烯酸等沉淀法。

金属盐沉淀法利用溶液中某种溶质与某些金属离子反应，生成金属盐沉淀，而与其他组分分离的方法。选择性变性沉淀法二、膜分离技术

Membraneseparationtechnique

膜分离（membraneseparation）利用具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化。

膜分离技术的优点(advantage)处理效率高(efficient)，设备易于放大可在室温或低温下操作，适宜于热敏物质分离浓缩化学与机械强度最小，减少失活(lesseninactivate)无相转变，省能(tosaveenergy)有相当好选择性，可在分离、浓缩的同时达到部分纯化的目的选择合适膜与操作参数，可得到较高回收率系统可密闭循环，防止外来污染(topreventpollution)不外加化学物，透过液可循环使用，降低了成本，并减少对环境的污染膜分离存在的不足(deficiency)：膜面发生污染，使膜性能降低耐药性、耐热性、耐溶剂能力都有限。单独采用膜分离技术效果有限膜的分类按分离粒子或分子的大小分类依据膜内平均孔径、推动力和传递机制分类依据形态学孔膜大小：微滤膜0.05～10μm；超滤膜1～50n

m

膜对称性依据化学特性分类依据组件的个形和种类来分离微滤（0.05-10um）超滤(0.001-0.05um)反渗透(0.1-1nm)透析透析膜一般为孔径

5-10nm，主要用于分离和浓缩浓差极化与膜污染及清洗方法浓差极化(concentrationpolarization)：是指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被载留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来来越高。在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。溶剂向膜面流动相起溶质向膜面流动，当溶质向膜面的流动速度与浓度梯度使溶质向本体溶液扩散速度达到平衡时，膜面附近存在一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化膜污染(membranespollution)：是指处理物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。

清洗方法(washmethod)物理方法化学方法高流速水冲洗脉冲电解清洗电渗透反洗法稀酸稀碱酶法层析分离(chromatographicseparation)是利用混合液(mixedliquor)中各组分的物理化学性质（分了的大小(size)和形状(shape)、分子极性(polarity)、吸附力(adsorptivepower)、分子亲和力affinity、分配系数(partitioncoefficient)等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中（固定相；流动相）三、层析技术

chromatographytechnique层析技术分类Classification凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography离子交换层析ionexchangechromatography亲和层析affinitychromatography反相层析reversedphasechromatography疏水层析hydrophobicchromatography吸附层析adsorptionchromatography分配层析partitionchromatography根据分离原理分类按流动相分类气相层析液相层析按固定相分类纸层析柱层析薄层层析薄膜层析1.凝胶过滤层析

gelfiltrationchromatography

凝胶过滤层析(Gelfiltrationchromatography)是利用具有一定孔径的多孔凝胶作为固定相，把分子大小不同的物质分离开来的一种层析技术，又叫凝胶过滤(Gelfiltration)、分子筛层析(Molecularsievechromatography)和凝胶渗透层析(Gelpermeationchromatography)。目前经常使用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(生物胶、BioGelP)、琼脂糖凝胶(Sepharosegel)及由烷基葡聚糖与甲叉丙烯酰胺共价交联制成的Sephacryl等。

凝胶过滤层析的优点(advantage)1.凝胶介质不带电荷(noelectriccharge)，具有良好的稳定性(stability)，在很宽的范围内呈化学惰性。2.溶液中各种离子、小分子、去污剂、表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响。3.应用范围广，分子量(molecularweight)从几百到百万4.设备(equipment)相对简单simple、易于操作，分离周期短，连续分离时介质不需再生凝胶过滤原理principle凝胶过滤介质的参数(parameter)及性质(properties)粒度：理论塔板数，均匀度交联度和网度结构：sephadexG-15;G-25;G-50;G-75;G-100;G-150;G-200机械强度物理和化学稳定性2.离子交换层析

ionexchangechromatography

是指液相中的离子与固相交换基团中的离子的可逆交换反应。利用这个反应将要分离的蛋白质混合物先在一个pH值的溶液中全部溶解，而后流经固定相使之与固相上的离子进行交换，并吸附于固相上。再根据混合物中各组分解离度的差异，用不同离子强度或pH值的溶液分别洗脱下来，以达到分离混合物组分的目的。此即为离子交换层析。聚焦层析聚焦层析是在等电聚焦的基础上发展起来的，它以等电点的差异和离子交换行为为依据来分离纯化蛋白质的一种层析方法。既具有聚焦作用的性能，又有浓缩样品和分辨率高的优点。聚焦层析的固定相为多缓冲交换剂，流动相为多缓冲剂。制备电泳蛋白质的分离纯化方法利用吸附能力不同的分离纯化方法

吸附层析(Absorbentchromatography)是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中各组分分离的方法。通常用于蛋白质分离纯化吸附剂有硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)和活性炭等。一般从柱上洗脱出次序是：碱性蛋白→中性蛋白→酸性蛋白。不能用离子交换或凝胶层析等方法分开的蛋白质，如血清、粘蛋白、微管蛋白等，用此法分离有时可得到较好的效果。由于HA的吸附容量高、稳定性好，因此，在分离纯化蛋白质、酶、核酸和病毒等物质方面得到广泛应用，对于分离RNA、单链与双链DNA及杂型双链DNARNA等也是好材料。

蛋白质的分离纯化方法利用生物功能专一性的纯化方法亲和层析(Affinitychromatography)又称功能层析(Functionchromatography)和生物专一吸附(Biospecificabsorption)。它是根据生物大分子能与一些物质进行专一结合的特性而设计的层析方法。例如，一些酶的底物、辅酶、抑制剂、调节效应物能与相应的酶专一结合。激素和受体、抗原和抗体亦互为配基。因此，用化学方法可以把一种酶的底物或抑制剂连接到某种固相支持物(如Sepharose4B)上以制成专一吸附剂，并装进层析柱，再用含这种酶的样品溶液通过层析柱，结果该酶吸附在层析柱上，而其他不被吸附的酶或蛋白质等全部流出。接着用适当缓冲溶液把欲分离纯化的酶从层析柱上洗脱下来，这样酶可一次提纯。亲和层析的方法简便、迅速、高效、操作步骤少、活性不易丧失，是分离纯化蛋白质、酶、激素与重组蛋白最有潜力的技术。缺点是要分离一种物质必须找到适宜配基，并将其制成固相载体后方可进行这种层析。该法成功的另一关键是防止配基的脱落，通常选用的配基以亲和力适中，且特异性较强。

电泳技术

electrophoretictechnique所谓电泳，即带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极(Electrode)移动的现象。目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳、自由界面电泳及区带电泳。以区带电泳应用最广。区带电泳(Zoneelectrophoresis)是样品物质在一隋性支持物上进行电泳的过程，因电泳后样品的不同组分可形成带状区间。采用不同类型的支持物进行该电泳时，能分离鉴定小分子物质(如氨基酸、肽类和核苷酸等)和大分子物质(如蛋白质、核酸以及病毒颗粒等)。电泳的方式方法虽有所不同，但基本原理是相同的。颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的性质。移动速度主要决定于本身所带的净电荷量、颗粒的大小和形状。此外，还受到电场强度、溶液pH、离子强度、支持物的特性及电渗(Electronosmosis)等外界条件的影响。带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为泳动率(Migrationrate,m)或迁移率。醋酸纤维薄膜电泳

celluloseacetatemembraneelectrophoresis

有电渗小、分离速度快、样品用量少、分离清晰、对样品无拖尾和无吸附现象等优点，并且染色后可透明，更便于保存和定量分析。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、同工酶、胎儿甲种球蛋白、体液和核酸等方面的检测，并已成为医学和临床检验的常规技术。2.琼脂和琼脂糖凝胶电泳

AgaroseGelElectrophoresis

琼脂糖很容易制成各种形状的凝胶，容易掌握，容易保存，凝胶的均一性好、牢固、富有弹性，容易固定和干燥，还可制成清晰的干膜长期保存。琼脂或琼脂糖凝胶电泳(AgarorAgarosegelelectrophoresis)因胶的网孔大，液体多，近似于自由电泳，具有电泳速度快、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。聚丙烯酰胺凝胶电泳

acrylamidegelelectrophoresis

是以人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(ACr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。聚合时所用的催化剂可以是化学聚合催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED，加速剂)，也可以是光聚合催化剂核黄素和TEMED。凝胶的机械强度、弹性、网孔的大小主要取决于Acr和Bis的比例，胶的总浓度及聚合条件。

PAGE可按凝胶的形状分为盘状和垂直板电泳。又按凝胶中pH、缓冲液组成、凝胶孔径和电压梯度是否一致分为连续电泳和不连续电泳两种。不连续电泳具有较高的分辨力，这是因为在分离过程中，除了具有一般电泳的电荷效应外，还有浓缩效应和分筛效应。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）十二烷基硫酸钠(Sodiumdecylsulfate,SDS)是一种阴离子去污剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS蛋白质复合物（compound）。此复合物可用具有SDS的PAGE进行分离，通常把这种电泳称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。SDSPAGE则是根据各种蛋白质分子量的不同进行分离的。电泳前，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇进行热变性，巯基乙醇即使蛋白质分子中的二硫键还原，SDS破坏蛋白质亚基间的非共价键，使含有亚基(Subunit)的蛋白质解离成各个亚基。由于SDS带有较强的负电荷，使SDS蛋白质复合物大大超过天然蛋白原有的电荷，从而消除或掩盖了不同种类蛋白质分子原有电荷的差异。并且SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成长椭圆形，其短轴长度都为1.8nm左右，而长轴长度则与蛋白质分子量成正比。故蛋白质在SDSPAGE中的泳动率不再