临床免疫学检验技术

临床免疫学检验技术江西省胸科医院：熊国亮临床免疫学检验技术第1页一、概述免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学检验领域应用一门学科。免疫检验技术则重点阐述各类免疫学技术基本原理、方法类型和临床应用。19世纪末相继建立了凝集试验、沉淀试验和补体结合试验等三大经典血清学试验，用于检测病原微生物抗原或抗体对传染病诊疗起到主要作用。临床免疫学检验技术第2页一、概述伴随免疫学理论和试验技术发展，放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术、化学发光免疫技术、流式细胞免疫分析技术等免疫标识技术应用于临床免疫学检验，加紧了免疫学检验自动化、标准化进程，极大地提升了免疫学检验灵敏度，拓展了免疫学检测范围，从检测免疫相关物质（抗原、抗体、补体、免疫活性细胞和细胞因子等）到检测体液中微量物质（激素、酶、血浆微量蛋白、血药浓度、微量元素等）。临床免疫学检验技术第3页一、概述免疫检验技术以其特有特异性、敏感性和微量、快速、稳定等优势被广泛应用于临床医学。临床免疫学检验技术第4页二、免疫检验技术在临床免疫学检验应用1.传染病免疫学检验机体被细菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体等微生物感染后，常可在血清中出现与病原体相对应特异性抗体，检测这类抗体有利于明确疾病诊疗（血清学诊疗）。另外，还能够用含有特异性抗体诊疗血清判定对应病原体及相关抗原，为确定传染病原提供依据。临床免疫学检验技术第5页二、免疫检验技术在临床免疫学检验应用2.机体天然免疫检测主要是对各种吞噬细胞如中性粒细胞、NK细胞、单核巨噬细胞功效进行检测以及检测在机体组织损伤、局部缺血、急性感染与炎症反应时升高血浆蛋白，如C反应性蛋白，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿瘤浸润时快速显著地增高，可达正常水平倍。CRP是引发心脏病最强烈危险原因。临床免疫学检验技术第6页二、免疫检验技术在临床免疫学检验应用3.免疫球蛋白、循环免疫复合物和补体测定包含测定五类免疫球蛋白含量、血清总补体活性及补体成份含量和在各种疾病时血清中升高循环免疫复合物。临床免疫学检验技术第7页二、免疫检验技术在临床免疫学检验应用4.细胞免疫相关指标测定检测淋巴细胞亚群和淋巴细胞功效以及白细胞介素—2等各种细胞因子，用于判断机体细胞免疫功效情况。临床免疫学检验技术第8页二、免疫检验技术在临床免疫学检验应用5.本身抗体测定机体在发生本身免疫性疾病时，常可出现各本身抗体，用免疫学方法检测这些抗体，可为本身免疫性病诊疗、疾病状态判断和疗效监测提供依据。临床免疫学检验技术第9页二、免疫检验技术在临床免疫学检验应用6.肿瘤标志物测定免疫学方法定性或定量检测在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤细胞合成、释放或机体对肿瘤反应产生一些生化物质，对肿瘤筛查、判别诊疗、治疗后病情监测及预后判断都有主要意义。临床免疫学检验技术第10页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）原理：酶联免疫吸附试验是免疫酶技术固相酶免疫测定一个技术，是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面，再用酶标识抗原或抗体与已被固定对应抗体或抗原发生特异性反应，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度（A）值表示，所测A值与待测抗体或抗原水平呈相关关系。临床免疫学检验技术第11页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）此法惯用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载体，读取结果需用酶标仪。标识抗原或抗体所用酶常选择辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，HRP惯用底物有邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TMB），碱性磷酸酶普通采取对硝基苯磷酸酯（P-NPP）作为底物，产物为黄色对硝基酚，在405nm波优点有最高吸收峰。临床免疫学检验技术第12页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）根椐方法和步骤不一样可分为以下几个基本反应模式。1.间接法是检测样本中特异性抗体最惯用方法。将已知特异性抗原包被于固相载体上，加待检样本，若其中含特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原—抗体复合物；洗弃未反应成份，加酶标识抗抗体（普通为酶标识抗人IgG或葡萄球菌A蛋白），使在固相载体上形成抗原—待检抗体—标识抗体（或SPA）复合物；洗弃未反应成份，加酶底物，终止反应后，在一定波长下用酶标仪测吸光度（A）值判定待测抗体有没有或含量。间接法优点是制备一个酶标识抗抗体（或SPA），只需更换不一样固相抗原，便可检测各种抗体。如HCV-IgG抗体检测临床免疫学检验技术第13页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）2.夹心法夹心法有双抗体夹心法（测抗原）和双抗原夹心法（测抗体），二者试验步骤相同，但包被物、酶结合物和检测对象不一样。双抗体夹心法用于检测相对分子质量较大蛋白质抗原。先将已知特异性抗体包被于固相载体上，加待测样本，若其中有对应抗标准与固相抗体特异性结合；洗板后加入酶标识特异性抗体，使成包被抗体—待测抗原—酶标抗体复合物；抗原或抗体含量与所测吸光度（A）值呈正相关。如乙型肝炎HBsAg检测、抗HBs检测、HBeAg检测。临床免疫学检验技术第14页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）3.竞争法用于检测待检样本中未知抗原或抗体。以测定抗体竞争法为例，将已知抗体吸附于固相载体，洗涤除去未结合抗体，；加特异性抗原与包被抗体形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去游离抗原，加标本和酶标抗体，标本中抗体与酶标抗体竞争结合固相复合物中抗原。标本中抗体越多，其竞争力越强，与固相抗原结合酶标抗体越少，加酶底物显色，有色产物多少与酶标抗体量成正比，与被测抗体量成反比。如乙型肝炎总抗HBc检测、抗HBe检测。临床免疫学检验技术第15页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）4.捕捉法用于测定特异性IgM类抗体。被检血清中针对某抗原特异性IgM和IgG常同时存在，为防止IgG干扰，普通采取捕捉法来测定IgM。先将已知特异性抗体（如抗人μ链）包被于固相载体上，加待测人血清样本，其中IgM（IgM分子相对于固相抗μ链又是一个抗原）被固相抗μ链抗体特异性捕捉，形成IgM-抗IgM复合物。洗涤除去血清中其它Ig和杂质；加特异性抗原试剂，该抗原只与固相上特异性IgM结合。临床免疫学检验技术第16页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）洗涤除去未结合特异性抗原；加入针对特异性抗原酶标抗体，此酶标抗体只与固相上特异性抗原结合。洗涤除去未结合酶标抗体，加酶底物反应，色多少与标本中特异性IgM量成正比。如甲肝(抗HAV-IgM)检测、抗HBc-IgM检测。临床免疫学检验技术第17页三、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）5.生物素—亲合素ELISA（avidin—biotin—peroxi—dasecomplex，ABC-ELISA）是将生物素（biotin）和亲合素(avidin)或链霉亲合素(streptavidin,SA)引入ELISA方法。生物素是一个小分子物质，经活化后可高比度偶联抗体或抗原等大分子。亲合素（或链霉亲合素）与生物素结协力极强，一分子亲合素可与4个生物素分子结合。在反应系统中引入生物素和酶标识亲合素，可将ELISA反应多级放大，显著提升检测方法敏感性。临床免疫学检验技术第18页四、临床免疫室内质控（一）ELISA检测室内质控1．现实状况：ELISA法检测影响原因多，多为手工操作，极难标准化；未得到试验室重视，质控品起源有限或价格原因，操作人员意识不够，有些基层单位不是天天做或者根本没有做，有不知从何做起。临床免疫学检验技术第19页四、临床免疫室内质控2．质控品选择：除了试剂盒附带阴阳性对照以外，试验室还应该选择最少一个弱阳性质控品，靠近Cutoff值，S/CO值应该为2-4之间（最好是购置商品）。临床免疫学检验技术第20页四、临床免疫室内质控3．临界值与弱阳性质控血清不一样点（1）临界值血清：试验结果处于（阴、阳性）分界点时样品中分析物浓度值，低于此值，定性试验结果为阴性，高于此值，定性试验结果为阳性。对于定性试验来讲，临界值是唯一医学决定水平，当样品中被测物浓度处于临界水平时，定性试验重复检验同一样品，将产生50%阳性结果和50%阴性结果。当样品浓度在临界值以上增加时，阳性结果比率增加；而当样品浓度在临界值以下减低时，阴性结果比率增加。临床免疫学检验技术第21页四、临床免疫室内质控（2）弱阳性质控血清：A《医疗机构临床试验室管理方法》弱阳性定为S/CO=2-4；B用阴性混合血清梯度稀释阳性混合血清，用现用检测系统进行检测所能测出阳性结果最低浓度。C质控品S/CO值-3S≥1最低浓度水平。临床免疫学检验技术第22页四、临床免疫室内质控4．测定频度：每次检测患者样本时最少测定一次室内质控品；ELISA测定每块板都要测定室内质控品。5．质控图绘制：定性测定可采取弱阳性质控品S/CO值作质控图。判定规则为12S（警告限），13S。临床免疫学检验技术第23页四、临床免疫室内质控（二）标本量少定量测定项目标质控方法是“即刻法”质控（Grubs异常值取舍法）（1）对于一些不是天天开展项目、使用期限较短试剂盒项目，用上述方法计算取得平均数和标准差有很大难度。采取Crubbs氏法，只需连续测定3次，即可对第3次检验结果进行检验和控制。含有计算方法以下：临床免疫学检验技术第24页四、临床免疫室内质控

A.计算出测定结果（最少3次）平均值（X）和标准差（S）。

B.计算SI上限值和下限值:SI上限值=(X最大值-X)/SSI下限值=(X-X最小值)/S临床免疫学检验技术第25页四、临床免疫室内质控C.查表，将SI上限SI下限与SI值表中数值进行比较

nn3s

n2snn3s

n2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.66

2.3761.941.82152.702.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56临床免疫学检验技术第26页四、临床免疫室内质控当SI上限和SI下限值〈n2s时，表示处于控制范围之内，能够继续进行测定，并重复以上计算；当SI上限和SI下限有一值处于n2s和n3s值之间时，说明该值在2s-3s临床免疫学检验技术第27页四、临床免疫室内质控范围，处于“警告”状态；当SI上限和SI下限值有一值处于>n3s时说明该值在3s范围以外，属“失控”。数字处于“警告”和“失控”状态应舍去，重新测定该项目质控品和病人样本。舍去只是失控这次数值，其它次测定值仍可继续使用。当检测数字超出20次以后，可转入使用常规质控方法进行质控。临床免疫学检验技术第28页四、临床免疫室内质控（三）其它免疫检测质控1．定量测定参考临床化学规则和失控判定（如化学发光仪检测肿瘤标识物项目）。2．胶体金、胶体硒等试纸条快速检测可不做室内质控品测定。3．凝集试验：血凝及乳胶凝集试验室内质控品可采取试剂盒带阴阳对照。临床免疫学检验技术第29页五、ELISA检测中注意事项临床免疫学检验技术第30页试剂原因:抗原抗体纯度,抗体亲和力、标识物比活性或免疫活性等均对测定结果产生直接影响。试剂盒稳定使用期,运输条件及储存方式等也均会对结果产生一定程度影响。ELISA检测主要影响原因临床免疫学检验技术第31页ELISA检测主要影响原因标本原因:内源性物质和外源性物质干扰。内源性物质常见有:类风湿因子(RF)、嗜异性抗体(Id)、补体、人抗动物抗体(HAAA)、药品及其致代谢产物和交叉反应物质等等。RF、Id和等干扰机制相同,均为固相抗体和标识抗体之间桥联抗原,在夹心法中易产生假阳性。临床免疫学检验技术第32页ELISA检测主要影响原因对于含有内源性干扰物标本能够作以下处理:(1)去除分析用抗体Fc片段,用F(ab)2替换完整IgG,能够降低RF、Id和HAAA等对分析结果影响;(2)用63℃,10min或56℃,30min热处理来降低RF和补体等对结果影响;(3)用2巯基乙醇加入标本稀释液中,可使RF降解,用EDTA稀释标本可缓解补体对结果干扰;临床免疫学检验技术第33页ELISA检测主要影响原因设备：加样系统、孵育设备、洗板机、酶标仪环境原因：水质操作：标本处理、加样、温育、洗板、显色、终止临床免疫学检验技术第34页设备卫生行业标准－乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法(WS/T223－)酶标仪在450nm和492nm波长不精密度应在≤1%，分别在449nm-451nm和491nm-493nm之间，吸光度（A值）要求能够测到小数点后两位；临床免疫学检验技术第35页设备移液系统在100μl和50μl移液不精密度应≤1%，分别在99-101μl和49.5μl-50.5μl之间；恒温系统在37℃、43℃温度变异应成士I℃。临床免疫学检验技术第36页RF多为IgM型，也有IgG和IgA型。RF含有与变性IgG产生非特异性结合特点，所以在ELISA检测过程中可能与固相上包被抗体及酶标抗体结合，并将这藕连起来产生假阳性结果。这种情况在利用捕捉法测定IgM型抗体过程中尤其严重。因为捕捉法测定IgM型抗体试剂盒中固相上包被抗体为抗人μ链。内源性干扰临床免疫学检验技术第37页内源性干扰补体:补体经典活化路径从C1q开始,在固相抗体和酶标抗体吸附及结合过程中,抗体分子可能发生变构,从而使Fc段补体C1q分子结合点暴露出来,则C1q可将二者连结起来,造成假阳性。临床免疫学检验技术第38页内源性干扰可采取RF吸附剂去除RF，63℃10min或56℃30min灭活补体采取抗体Fab段替换完整IgG可有效防止RF干扰。临床免疫学检验技术第39页溶血：Hb含有血红素基团含有类似过氧化物活性，若标本中Hb浓度过高则可能吸附于固相并于随即加入HRP底物反应显色。外源性干扰：临床免疫学检验技术第40页外源性干扰：细菌污染：细菌一些内源性酶本身会对用对应酶作标识测定方法产生干扰。标本贮存时间过长：标本在2-8℃保留时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会造成本底过深甚至假阳性。临床免疫学检验技术第41页外源性干扰：标本凝固不全：血液采集后如搜集管中促凝剂和抗凝剂，血液普通在半小时后开始凝固。在临床工作中可能因为赶时间而在血液还未凝固之前就强行离心分离血清，此时分离“血清”可能残留有部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中形成纤维蛋白而沉积、吸附在酶标板内，而常规洗板难以完全去除。临床免疫学检验技术第42页溶血和非溶血、脂浊与非脂浊两组样品A值无统计学意义。AFP、RF、补体、本身抗体阳性样品吸光度值显著高于对照组吸光度值,含有统计学意义,这可能是AFP、RF、补体和一些本身抗体能够与固相一抗,标识二抗Fc结合或影响它们结合而造成假阳性三种不一样温育方式均会造成边缘效应,中央孔和周围孔吸光度有显著性差异但水浴法温育比较稳定,边缘效应相对较小,孵箱法较大,微波法最为显著。临床免疫学检验技术第43页临床免疫学检验技术第44页提议:①使用抗凝血标本,便于标本离心分离。②不抗凝血液标本过夜之后才检测,让血凝块愈加好地收缩,让标本中非特异性物质被充分地包裹,降低非特异性反应所致假阳性率[2]。③标本离心时,加大离心转速,延长离心时间,使红细胞和纤维蛋白充分沉降,使标本离心分离愈加彻底[3]④标本加样时防止加入红细胞和/或纤维蛋白,防止这两种干扰物质对试验结果影响临床免疫学检验技术第45页临床免疫学检验技术第46页12份HBsAg阳性血清标本按常规检测,加显色剂后,不加终止剂,在酶标仪上每5min测一次410nmOD值42份HBsAg阳性血清标本做三排孔检测,每排分别加酶标识抗体40μl、50μl、60μl,其余按说明书操作并测定OD值。临床免疫学检验技术第47页加酶结合物前放置不一样时间得到抗HBc结果：随机检测44份抗HBc阴性血清样品,加样后室温25℃分别放置0、5、10、15、20、30min后加入酶结合物,其后严格按说明书操作。结果0、5、10、15、20、30min阳性率分别为0、2.3%(1/44)、11.4%(5/44)、15.9%(7/44)、20.5%(9/44)、22.7%(10/44),与加入酶结合物0min组阳性率相比较:5min组P>0.05,10min组P<0.05,其余各组P均<0.01。不一样人员稀释样品所得到抗HBc结果将5份抗HBc临界阴性血清混合,选择4名检验人员按照各自工作习惯对混合血清分别稀释16孔(稀释百分比为1∶30),同时用振荡器平行稀释16孔作为标准对照,将全部稀释样品随机加入同一酶标板中。试验结果显示:4名检验人员检测结果(S/CO.x±s,A值)和标准对照结果分别为0.85±0.09、0.96±0.11、1.17±0.11、0.97±0.17、1.31±0.11,两两比较差异都有统计学意义临床免疫学检验技术第48页方法1：检测样本39℃水浴,反应孔底部不接触水面;方法2：37℃水浴,反应孔底部2/3浸入水中;方法3：反应板置37℃干式孵育箱孵育方法2、3之间无显著性差异;方法2、3与方法1间差异有显著性方法1液面上方温度是经过水温进行调整,所以反应板孵育时升温比较迟缓,到达平衡温度所需时间也较长。所以采取该方法对检测结果影响较大。方法3孵育时反应孔四面受热均匀,所以反应板到达平衡温度时间要短于方法1,且反应体系中各种物质作用较为均匀,结果也比较稳定。3种孵育方式均会产生不一样程度边缘效应。其中方法1对结果影响最大临床免疫学检验技术第49页三种不一样温育方式均会造成边缘效应,中央孔和周围孔吸光度有显著性差异但水浴法温育比较稳定,边缘效应相对较小,孵箱法较大,微波法最为显著。临床免疫学检验技术第50页临床免疫学检验技术第51页12份HBsAg阳性血清标本按常规检测,加显色剂后,不加终止剂,在酶标仪上每5min测一次410nmOD值42份HBsAg阳性血清标本做三排孔检测,每排分别加酶标识抗体40μl、50μl、60μl,其余按说明书操作并测定OD值。临床免疫学检验技术第52页加终止液后伴随时间增加,A值逐步下降。而且浓度越高其A值随时间下降越快。但弱阳性HBsAg质控物,其A值并不随时间增加而改变,在终止反应后28min内一直处于同一水平；HBsAg、抗HBs、HBeAg三项结果阴阳性判断似乎不受时间影响,其原因有待深入研究。但对于竞争法而言,可能会产生假阳性或假阴性结果,所以提议在终止反应后马上比色。临床免疫学检验技术第53页同时稀释测定法PEG法:酶标二抗试剂中加入4%PEG600振动态ELISA法:，该方法可将HOOK效应发生临界浓度降低两个稀释度尽可能选择测定范围宽试剂盒；每一批号试剂盒随样本做高浓度质控(10000ng/ml)：临床免疫学检验技术第54页注：计算公式：依据正态分布u检验单侧99.5%可信限，u值=2.58临床免疫学检验技术第55页上海市临床试验室质量管理基本内容和要求（年）:

复检范围确实定按以下公式计算：cutoff值×0.8≤样品测定值≤cutoff值×3，不得小于此范围。临床免疫学检验技术第56页以(CO-2s)作为阳性低限判断值,其中s值是以卫生部临检中心临界质控血清(HBsAg1ng/ml,抗HCV2NCU/mlRCVK所测得s值。CO至(CO—2s)范围称为灰区。理由为:国产试剂盒CO普通是以阴性对照A值加或乘一个常数得出,阴性对照是小牛血清而非人血清,A值不超出0105即按0105计算,亦即CO为一不变常数,这么就忽略了试剂批间差、板间差和操作误差;国产试剂灵敏度普遍不高,如HBsAg进口试剂灵敏度为0.1～0.21ng/ml而国产试剂为0.5～11ng/ml,普通认为0.11ng/ml即有传染性。临床免疫学检验技术第57页六、酶标仪使用及维护1．酶标仪基本原理酶标仪实际上就是一台变相专用光电比色计或分光光度计。光源灯发出光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔板中待测标本，该单色光一部分被标本吸收，另部分则透过标