基因工程的基本操作程序使用修改

基因工程的基本操作程序使用修改第1页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因工程培育抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)第2页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建第3页，共82页，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的获取1、目的基因：主要是编码蛋白质的结构基因也可以是一些具有调控作用的因子第4页，共82页，2023年，2月20日，星期四补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。第5页，共82页，2023年，2月20日，星期四①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子与RNA聚合酶结合位点启动子、终止子一段有特殊结构的DNA片断，基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录——启动子一段有特殊结构的DNA片断，基因的尾端，使转录终止——终止子第6页，共82页，2023年，2月20日，星期四补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：第7页，共82页，2023年，2月20日，星期四真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。第8页，共82页，2023年，2月20日，星期四结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA第9页，共82页，2023年，2月20日，星期四原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______

区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第10页，共82页，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的获取1、目的基因：2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）人工合成：通过DNA合成仪用化学方法直接合成主要是编码蛋白质的结构基因也可以是一些具有调控作用的因子第11页，共82页，2023年，2月20日，星期四（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库

基因组文库部分基因文库（cDNA文库）第12页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因组文库的构建模式图注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。第13页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较第14页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因组文库与部分基因文库的关系第15页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第16页，共82页，2023年，2月20日，星期四思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；

基因翻译产物蛋白质等特性。第17页，共82页，2023年，2月20日，星期四（二）利用PCR技术扩增目的基因第18页，共82页，2023年，2月20日，星期四（二）利用PCR技术扩增目的基因第19页，共82页，2023年，2月20日，星期四1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第20页，共82页，2023年，2月20日，星期四模板DNA95℃第21页，共82页，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物第22页，共82页，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第23页，共82页，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始第24页，共82页，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第25页，共82页，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第26页，共82页，2023年，2月20日，星期四PCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚CPCR总结：第27页，共82页，2023年，2月20日，星期四第28页，共82页，2023年，2月20日，星期四Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020第29页，共82页，2023年，2月20日，星期四①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。③前提条件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNA第30页，共82页，2023年，2月20日，星期四

过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸第31页，共82页，2023年，2月20日，星期四⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第32页，共82页，2023年，2月20日，星期四思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2×（2n-1）(n为循环次数)（24-1）×2=30第33页，共82页，2023年，2月20日，星期四PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第34页，共82页，2023年，2月20日，星期四

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（三）化学方法人工合成目的基因第35页，共82页，2023年，2月20日，星期四人工合成(基因比较小)DNA合成仪第36页，共82页，2023年，2月20日，星期四从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法第37页，共82页，2023年，2月20日，星期四用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。用_____________切断目的基因，使其产生_________________。将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶1.过程:二、构建表达载体——核心第38页，共82页，2023年，2月20日，星期四质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因过程:第39页，共82页，2023年，2月20日，星期四2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。第40页，共82页，2023年，2月20日，星期四科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:第41页，共82页，2023年，2月20日，星期四思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）

不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。

第42页，共82页，2023年，2月20日，星期四（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。第43页，共82页，2023年，2月20日，星期四3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因第44页，共82页，2023年，2月20日，星期四调节基因操纵基因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶启动子RNA聚合酶启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。第45页，共82页，2023年，2月20日，星期四思考1：

表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。第46页，共82页，2023年，2月20日，星期四思考2：终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？第47页，共82页，2023年，2月20日，星期四①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。第48页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因工程技术路线第49页，共82页，2023年，2月20日，星期四三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（一）转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第50页，共82页，2023年，2月20日，星期四（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞第51页，共82页，2023年，2月20日，星期四1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法第52页，共82页，2023年，2月20日，星期四（1）农杆菌转化法①特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。第53页，共82页，2023年，2月20日，星期四③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌第54页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物第55页，共82页，2023年，2月20日，星期四（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物第56页，共82页，2023年，2月20日，星期四胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第57页，共82页，2023年，2月20日，星期四2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？第58页，共82页，2023年，2月20日，星期四（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物第59页，共82页，2023年，2月20日，星期四常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性第60页，共82页，2023年，2月20日，星期四受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）

A.将毒素蛋白注射到受精卵中

B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养

C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵

D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中BC第61页，共82页，2023年，2月20日，星期四四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定第62页，共82页，2023年，2月20日，星期四1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测第63页，共82页，2023年，2月20日，星期四基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。第64页，共82页，2023年，2月20日，星期四DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。第65页，共82页，2023年，2月20日，星期四（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原-抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。第66页，共82页，2023年，2月20日，星期四提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养第67页，共82页，2023年，2月20日，星期四若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达第68页，共82页，2023年，2月20日，星期四类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定

包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测第69页，共82页，2023年，2月20日，星期四提示：

①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；

②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。第70页，共82页，2023年，2月20日，星期四第71页，共82页，2023年，2月20日，星期四第72页，共82页，2023年，2月20日，星期四归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译第73页，共82页，2023年，2月20日，星期四为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。第74页，共82页，2023年，2月20日，星期四利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：第75页，共82页，2023年，2月20日，星期四根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能