均相酶反应动力学

均相酶反应动力学第1页/共93页第三章均相酶催化反应动力学

酶催化反应的基本特征简单的酶催化反应动力学有抑制的酶催化反应动力学多底物酶催化机理第2页/共93页

实例：脂肪酶催化酯化反应：生物柴油油料甘油+脂肪酸甲醇NaOH生物柴油

高果糖浆：淀粉浆液α-淀粉酶糊精糖化酶葡萄糖葡萄糖异构酶果糖第3页/共93页化学反应的基础知识

反应进行的方向反应进行的可能性反应进行的限度化学热力学

反应进行的速率反应机制

化学动力学第4页/共93页反应速率及其测定

反应速率：单位时间内反应物或生物浓度的改变。设瞬时dt内反应物浓度的很小改变为ds，则：

若用单位时间内生成物浓度的增加来表示，则：第5页/共93页反应分子数反应分子数：是在反应中真正相互作用的分子的数目。如：AP属于单分子反应根据质量作用定律，单分子反应的速率方程式是：

双如：A+BC+D属于双分子反应其反应速率方程可表示为：

判断一个反应是单分子反应还是双分子反应，必须先了解反应机制，即了解反应过程中各个单元反应是如何进行的。第6页/共93页反应级数

根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。例：对于某一反应其总反应速率能以单分子反应的速率方程式表示，那么这个反应为一级反应。又如某一反应：A+BC+D

式中K为反应速率常数符合双分子反应的表达式，为二级反应。

把反应速率与反应物浓度无关的反应叫做零级反应。第7页/共93页

反应分子数和反应级数对简单的基元反应来说是一致的，但对某些反应来说是不一致的。例如：是双分子反应，但却符合一级反应方程式。因为蔗糖的稀水溶液中，水的浓度比蔗糖浓度大得多，水浓度的减少与蔗糖比较可以忽略不计。因此，反应速率只决定于蔗糖的浓度。第8页/共93页酶促反应动力学基础——反应速率零级反应一级反应ABK积分后得：K是反应速率常数，C是积分常数若反应开始（t=0）时，A=A0,则C=lnA0，最后得到：A=A0e-kt一级反应第9页/共93页二级反应A+BCKK指反应的速率常数反应速率与反应物的性质和浓度、温度、压力、催化剂及溶剂性质有关第10页/共93页酶促反应动力学基础——

平衡常数

平衡：可逆反应的正向反应和逆向反应仍在继续进行，但反应速率相等。反应的平衡常数与酶的活性无关，与反应速率的大小无关，而与反应体系的温度、反应物及产物浓度有关。平衡常数（K）的计算：例：A+3B2C+D第11页/共93页酶的基本概念酶可加快反应速率降低反应的活化能（E0）不能改变反应的平衡常数K不能改变反应的自由能变化（ΔG）酶有很强的专一性较高的催化效率反应条件温和酶易失活第12页/共93页第13页/共93页酶与底物的作用机理LockandkeyModel第14页/共93页Induced-FitModel象手与手套的关系。当底物接近酶的活性中心并与之结合时，酶的构象能发生改变，更适合于底物的结合。第15页/共93页酶促反应动力学基础影响酶促反应的主要因素

浓度因素（酶浓度，底物浓度，产物浓度等）外部因素（温度，压力，pH，溶液的介电常数，离子强度等）内部因素（效应物，酶的结构）第16页/共93页酶反应动力学酶反应动力学的两点基本假设：反应物在容器中混合良好反应速率采用初始速率第17页/共93页单底物酶促反应动力学＋k1k2ESES＋Ek3Pk4快速平衡学说的几点假设条件：酶和底物生成复合物[ES]，酶催化反应是经中间复合物完成的。底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。不考虑P+EES这个可逆反应的存在。

[ES]在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。第18页/共93页快速平衡学说对于单底物的酶促反应：由假设4可得到：

由假设3可得到产物的合成速率：(1)(2)第19页/共93页反应体系中酶量守恒：由前面的公式（1）得：代入公式（3），变换后得：对于酶复合物ES的解离平衡过程来说，其解离常数可以表示为，即，代入公式（2）得到（3）（4）（5）第20页/共93页当反应初始时刻，底物[S]>>[E]，几乎所有的酶都与底物结合成复合物[ES]，因此[E0]≈[ES]，反应速率最大，此时产物的最大合成速率为：代入式（5）得：式中：Vp,max：最大反应速率如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。

Ks：解离常数，饱和常数

低

Ks值意味着酶与底物结合力很强。（6）第21页/共93页稳态学说1.酶和底物生成复合物[ES]，酶催化反应是经中间复合物完成的。2.底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。3.在反应的初始阶段，产物浓度很低，P+EES这个可逆反应的速率极小，可以忽略不计。4.[ES]的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。第22页/共93页当反应系统中[ES]的生成速率与分解速率相等时，[ES]浓度保持不变的状态成为稳态。Experimentaldatademonstratedtheconcentrationprofiles.第23页/共93页由于[S]>>[E0]，所以[S]>>[ES]，[S]-[ES]≈[S]根据稳态假说，(7)(3)(8)第24页/共93页(9)(10)式中：Km米氏常数Michaelis-Menten第25页/共93页第26页/共93页快速平衡学说与稳态学说在动力学方程形式上是一致的，但Km和Ks表示的意义是不同的。当k+2<<k-1时，Km=Ks这意味着生成产物的速率远远慢于[ES]复合物解离的速率。这对于许多酶反应也是正确的。MixedorderwithrespecttoS第27页/共93页底物浓度与反应速率的关系第28页/共93页反应速率、底物浓度与时间的关系第29页/共93页米氏常数Km的意义？

Km值代表反应速率达到Vmax/2时的底物浓度。

Km是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH能影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。

Km值可以判断酶的专一性和天然底物。当k+2<<k-1时，Km

＝KS

，那么Km可以作为酶和底物结合紧密程度的一个度量，表示酶和底物结合的亲合力大小。若已知Km值，可以计算出某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。例如:当[S]=3Km时，代入米氏方程后可求得v=0.75Vmax。

Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km值往往是不同的，例如谷氨酸脱氢酶，NAD+的Km值为2.5×10-5mol/L，而NADH为1.8×10-5mol/L。测定这些Km值的差别及正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率。第30页/共93页问题为什么只有初始反应速率可以使用？产物的积累使逆反应的影响不可忽略产物可能会抑制或激活酶的活力随着反应的进行，酶的活力可能会失活反应体系中的一些杂质可能会影响到酶的活性……为什么说低Km值意味着酶与底物的结合力强？考虑一下km的定义：第31页/共93页动力学参数的求解作图法（通过方程变换，将方程线性化）L-B法H-W法E-H法积分法非线性最小二乘法回归处理信赖域法（Matlab的优化工具箱）遗传算法（不依赖于初值，可并行计算）第32页/共93页L-B双倒数法将米氏方程式两侧取双倒数，得到下列方程式：以作图,得到一直线缺点：实验点过分集中在直线的左下方，影响Km和Vmax的准确测定。第33页/共93页积分法分批酶反应体系中[S]随时间的变化过程可以用表示为：积分得到,或,与对应作图，得到一直线，斜率为-Km,截距为Vm。第34页/共93页例1：如果要求反应速度达到Vmax的99%，求其底物浓度。

解：例2：过氧化氢酶的Km值为25mmol/L，当底物过氧化氢浓度为100mmol/L时，求在此底物浓度下过氧化氢酶被底物饱和的百分数。解：得，即，

认为有80%的酶已与底物作用生成了中间产物，故过氧化氢酶在此时被底物饱和的百分数为80%。第35页/共93页例3有一均相酶催化反应，Km值为2×10-3mol/L，当底物的初始浓度[S0]为1×10-5mol/L时，若反应进行1min，则有2%的底物转化为产物。试求出：（1）当反应进行3min，底物转化为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别为多少？（2）当[S0]为1×10-6mol/L时，也反应了3min，底物和产物的浓度是多少？（3）最大反应速率Vmax值为多少？

解：（1）根据题意，[S0]＜0.01Km，

所以V=Vmax[S0]/Km=-ds/dt

即，ln([S0]/[S])=Vmax/Kmt

反应进行1min时，[S]=（1-2%）×[S0]=0.98×10-5mol/L

∴Vmax/Km=0.0202min-1

反应进行3min时，ln([S0]/[S])=0.0202×3=0.0606

∴[S]=0.94×10-5mol/L，XS=6%

……第36页/共93页抑制剂对酶促反应速率的影响几个概念失活与抑制

【失活】(inactivation)：由于酶蛋白分子变性而引起的酶活力丧失的现象称为失活。

【抑制】(inhibition)：由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失，称为抑制作用底物与效应物

【效应物】(Effecter)：凡能使酶分子发生别构作用的物质叫效应物，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性降低的物质称为负效应物。第37页/共93页竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制可逆抑制

可逆抑制和不可逆抑制(如铅和汞等重金属)【可逆抑制】(reversibleinhibition)：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复性，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。不可逆抑制抑制第38页/共93页竞争性抑制(competitiveinhibitions)

ESIEIXP抑制剂是底物的类似物E+S+I[ES]E+P[EI]KIKm’第39页/共93页利用快速平衡假说:和酶的浓度方程,产物速率方程,综合以上方程,消除[ES]得到：where

and

。第40页/共93页Theneteffectofcompetitiveinhibitionsisan

increasedvalueofwith

reduced

reactionrate,but

samemaximumreactionrate.Furthermore,thecompetitiveinhibition

canbeovercome

byhighsubstrateconcentration.竞争性抑制(competitiveinhibitions)第41页/共93页非竞争性抑制(Non-competitiveInhibitions)ESEISIXP这种抑制剂能结合于酶的非活性中心，但能降低酶与底物的亲和力。E+S+I[ES]+IE+P[EI]+S[ESI]Km’Km’KIKI第42页/共93页Withsimilarequationsandderivationsasbefore,Where.wecanget,第43页/共93页Theneteffectofnon-competitiveinhibitionsisa

reductionin

with

same

Michaelis-Mentenconstant.Highsubstrateconcentration

wouldnot

overcomenon-competitiveinhibitions.

Otherreagents

needtobeaddedtoblockbindingofittotheenzyme.PlotsonNon-competitiveInhibitions第44页/共93页反竞争性抑制(UncompetitiveInhibitions)SEI+ESESIXP这种抑制剂仅能与ES复合物结合，而与游离酶不能直接结合。E+S[ES]+IE+P[ESI]Km’KI第45页/共93页Withsimilarequationsandderivativesasbefore,whereand.

wecanget,第46页/共93页PlotsonUncompetitiveInhibitionsObviously,theneteffectofuncompetitiveinhibitionsisa

reduction

inbothand,andthenetresultis

a

reduction

inreactionrate.第47页/共93页各种抑制的比较竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制第48页/共93页例在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为2.2×10-1mmol/L的抑制剂，并测其初始的反应速率，其数据见下表。底物初始浓度mmol/L无抑制时速率mmol/(L﹒min)有抑制时速率mmol/(L﹒min)0.1028180.1536240.2043300.5063510.707463试根据上述数据决定其抑制类型及动力学参数值。第49页/共93页解：将上述实验数据分别取其倒数，以1/v-1/[S]作图，得到下图的两条直线，他们在纵轴上有一共同点，这表明该抑制为竞争性抑制。1/Vsi-1/[S]1/Vs0-1/[S]第50页/共93页Vmax=1/0.010=100mmol/LKm=1/(0.0104/0.0026)=0.25mmol/LKmI=1/(0.0108/0.0045)=0.42mmol/LKI=0.27mmol/L第51页/共93页底物抑制(SubstrateInhibitions)高浓度的底物会抑制一些酶促反应。EES+SSESSXPE+S[ES]+SE+P[ESS]Km’KSIk+2第52页/共93页Withsimilarequationsandderivationsasbefore,变换方程得：Then,wecanget,第53页/共93页即为

,.即

,则

或

即,,则

或

DiscussionsaboutSubstrateInhibitions反应速率最大时,其底物浓度为:

低物浓度很低时,即为没有抑制剂存在情况下的米氏方程.

底物浓度很高时,底物的抑制性就很明显.第54页/共93页Atlowsubstrateconcentration,therateexpressionapproximatestotheMichaelis-Mentenequation,thenthecurveindouble-reciprocal(双倒数)plotis

parallel(平行)

withthelinearlinedenotedtheinstancewithoutsubstrateinhibition.Similarly,

athighsubstrateconcentration,thecurveindouble-reciprocalplot

isin

hyperbolic(双曲线)

mode.PlotsonSubstrateInhibitions第55页/共93页产物抑制(productinhibitions)EESEPPSPE+S+P[ES]E+P[EP]Km’KPk+2第56页/共93页影响酶催化反应速率的因素影响酶催化反应速率的因素有很多，它们会影响到酶的结构或化学状态。pH温度表面张力化学试剂(醇,脲和过氧化物)辐射(光,微波,离子化,

g

射线等)第57页/共93页pH对酶促反应的影响一些酶的活性中心存在离子基团，因此VariationofpH另一方面，底物分子中包含离子基团，反应体系的pH也有可能会影响到底物与酶结合的亲和力。Ionicform(离子形式)ModifiesReactionrateChanges

Enzymeactivity(酶活)Influences

第58页/共93页ForCASEI(IonicEnzyme):Thereactionschemeisasfollow:Wherethemeaningsofthedenotationsare:EH:activeformE-,EH2+:inactiveformE-:deprotonationform(还原态)EH2+:protonationform(氧化态)第59页/共93页Withsimilaranalysisandderivationsasbefore,wecanget,where第60页/共93页

考虑到酶发挥最佳的活力状态是EH，最佳pH应该是唯一的，而在最佳pH时，EH的浓度应该达到最大。为什么酶反应的最佳pH会是在pK1和pK2之间?因此，我们现在只要考察酶与质子H+的相互作用。根据解离常数的定义和酶的质量守恒可得：第61页/共93页消除[E-]和[EH2+]项，可得到：令得到,即,第62页/共93页ForCASEII(IonicSubstrate)Thereactionschemeisasfollow:Similarly,wecanget,

where

SH+

+

E+S

+

H+H+ESH+Km'E

+

HP+k2K1EH++SKm'第63页/共93页

一般来说中，酶促反应的最佳pH还是很难预测的，通常需要通过实验来确定。pH-activityprofilesoftwoenzymes.

(A)胃蛋白酶;(B)延胡索酸酶(以苹果酸为底物时)

第64页/共93页温度对酶促反应的影响

在较低的温度范围内，酶催化反应速率会随着温度的升高而加快，超过某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上时，酶的反应速率反而随着温度的升高而下降。

这是由于温度升高，虽然可加速酶的催化反应速率，同时也加快了酶的热失活速率。第65页/共93页温度激活作用(上升区)酶催化反应速率常数中的k2与温度的关系符合Arrhenius方程:即,

式中[E]活性酶的浓度; Ea

是反应活化能(kcal/mol).R是气体常数

T是绝对温度，A是前因子第66页/共93页热失活作用(下降区)

(酶的热变性作用)酶的热变性失活符合一级反应动力学方程：式中[E0]酶的初始浓度;kd

变性常数.积分得到,

此外,

式中

Edisthedenaturationenergy(kcal/mol).第67页/共93页例2-1：将底物和酶加入到分批式反应器中，底物初始浓度为2mmol/L，经反应，转化率为90%，求反应所需的时间t。已知反应速率方程为:解：在分批式反应器中

即：积分得到：转化率为90%，即([S0]-[S])/[S0]=0.9,[S]=0.2第68页/共93页例2-2：假设某酶有两个活性中心，它的反应机制可用下图表示，试根据稳态假设，求其速率方程式E+S[ES]+SE+P[ESS]KmKSI[ES]+Pk+2k+2解：根据解离平衡过程可得

根据酶的质量守恒可得

将上面两式变换后可得

第69页/共93页变换方程可以得到以下两式：当反应速率达到最大时，所有的酶都以复合物的形式存在，则[E0]=[ES]+[ESS],Vmax=k+2([ES]+[ESS])=k+2[E0]第70页/共93页例2-3：某酶催化反应，其Km=0.01mol/L,现测得该反应进行到10min时，底物浓度为3.4×10-5mol/L,已知[S0]=3.4×10-4

mol/L.假定该反应可用M-M方程表示。试求：

(1)最大反应速率是多少?

(2)反应20min后，底物浓度为多少？解：已知米氏方程及题中条件知[S0]<<Km则米氏方程可表示为10min时,[S]=3.4×10-5,代入上式可得：Vmax=(0.01×ln10)/10=0.0023molL-1min-1当t=20min,ln[S]=ln[S0]-Vmaxt/Km

=ln(3.4X10-4)-0.0023X20/0.01[S]20min=3.42X10-6mol/L第71页/共93页Two-SubstrateReactionsRandomsequentialmechanisms(随机机制)Orderedsequentialmechanisms(顺序机制)Ping-Pongmechanisms(乒乓机制)第72页/共93页

所有底物(A和B)与酶结合后，反应才能发生；各底物与酶的结合次序及产物与酶的释放次序是随机的。I.RandomsequentialBiBimechanisms反应底物A,B与酶E结合产物P,Q从酶的结合点释放第73页/共93页I.RandomsequentialBiBimechanismsBimolecularsubstratesBimolecularproducts第74页/共93页AusefulrelationshipexistsamongaboveconstantsRearrangement,(a)第75页/共93页Relationshipofvand[A]Fromeq(a),then第76页/共93页Relationshipofvand[B]第77页/共93页Fixedsubstrateconcentrationdependenceforenzymesdisplayingrandomsequentialmechanisms.DependenceofV’maxon[A]DependenceofK’on[A]DependenceofV’maxon[B]DependenceofK’on[B]第78页/共93页II.OrderedsequentialBiBimechanisms所有底物(A和B)与酶结合后，反应才能发生；各底物与酶的结合及产物与酶的释放是按一定次序进行的。反应底物A,B与酶E结合产物P,Q从酶的结合点释放第79页/共93页Rearrangement,第80页/共93页Relationshipofvand[B]第81页/共93页Relationshipofvand[A]第82页/共93页FixedsubstrateconcentrationdependenceforenzymesdisplayingorderedsequentialmechanismsdependenceofV’maxon[B]dependenceofK’on[B]dependenceofK’on[A]第83页/共93页底物A和B始终不能同时与酶结合;至少有一个产物在所有底物完成反应之前从酶的结合位点释放.反应A与E结合P与E释放B与E结合反应Q与E释放生成产物P生成产物QIII.ping-pongB