第四章 蛋白质

第一章蛋白质的化学ChemistryofProtein什么是蛋白质(protein)?

由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物生物学重要性组成成分参与多种生理功能氧化供能——生命的“执行者”第一节蛋白质的分子组成TheMolecularComponentofProtein一、元素组成主要元素:C、H、O、

、S微量元素:铁、铜、锌、锰、钴、钼、磷、碘N16%样品中蛋白质的含量(g%)=样品含氮克数×6.25（一）氨基酸结构组成人体蛋白质的氨基酸仅20种α-氨基酸(Pro除外)L-氨基酸(Gly除外)二、氨基酸(aminoacids)αα-氨基酸结构通式

脯氨酸

Pro（亚氨基酸）L-氨基酸的通式RCH3丙氨酸H甘氨酸

（二）氨基酸的分类1.依据R基团分类非极性氨基酸极性不带电荷氨基酸带负电荷氨基酸带正电荷氨基酸非极性疏水性氨基酸甘氨酸

glycine

Gly

G

丙氨酸

alanineAlaA

缬氨酸

valineValV

亮氨酸

leucine

LeuL

异亮氨酸

isoleucineIleI

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

脯氨酸

prolineProP

色氨酸

tryptophanTryW

丝氨酸

serineSerS

酪氨酸

tyrosineTryY

半胱氨酸

cysteine

CysC

蛋氨酸

methionine

MetM

天冬酰胺

asparagine

AsnN

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

苏氨酸

threonine

ThrT2.极性中性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

谷氨酸

glutamicacidGluE

赖氨酸

lysineLysK

精氨酸

arginine

ArgR

组氨酸

histidineHisH

3.酸性氨基酸4.碱性氨基酸特殊分类含硫：Cys、Met含酰胺：Asn、Gln含羟基：Ser、Thr、Tyr芳香族：Phe、Tyr、Trp支链：Val、Leu、Ile含胍基——Arg；含咪唑基——His

含吲哚基——Trp

（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类按营养需要营养必需氨基酸营养非必需氨基酸Met、Val、Lys、IlePhe、Leu、Trp、Thr

特殊氨基酸+-HH胱氨酸二硫键第二节蛋白质的分子结构TheMolecularStructureofProtein若让你研究一个未知蛋白质的结构，你最先想弄清什么？随后你该如何由简单到复杂地研究？一级结构二级结构三级结构四级结构空间构象一、一级结构1.定义蛋白质分子中氨基酸的连接方式、排列顺序和二硫键所在的位置2.维系键肽键,有些包括二硫键3.肽键(peptidebond)

由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键4.肽(peptide)由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)多肽链的书写与命名书写：一般丛N末端向C末端书写，书写多肽链时可用略号，N端写于左侧，用H做标帜，C端于右侧用OH表示。肽详细命名：某某酰某某酰……某某酸。

苏氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸

Ala-Gly-Pro-His和His-Pro-Gly-Ala是否为同一物质？

5.一级结构的测定氨基酸的组成氨基酸的排列顺序氨基酸组成的分析样品纯化（均一）确定多肽链数N末端分析C末端分析完全水解氨基酸测定

N末端分析方法二硝基氟苯法（DNFB）二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）Edman降解法氨肽酶法

DNFB法蛋白质（多肽）A+DNFBDNP蛋白质（多肽）A氨基酸DNPA

Edman

降解法蛋白质（多肽）A+PITCPTC蛋白质（多肽）APTHA蛋白质（多肽）

C末端分析方法肼解法羧肽酶法A:脂肪族或芳香族B:碱性氨基酸C:ProY:各种C端氨基酸氨基酸顺序的测定蛋白质（多肽）裂解酶解法化学法肽谱重叠分析酶解法（内肽酶）LysArg

aa

Phe

Trp

Tyr疏水aa

疏水aa

胰蛋白酶

糜蛋白酶胰凝乳蛋白酶

胃蛋白酶

化学法溴化氰Met（羧基肽键）羟胺Asn—Gly（Leu；Ala）例题今有一个七肽，经分析氨基酸组成为Lys

、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后为两个肽段，分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。此肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。若与胰蛋白酶反应也生成两段肽，分别为Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构怎样？氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列二、空间构象（一）定义蛋白质分子中原子和基团在三维空间

上的排列。主链构象侧链构象二、空间构象（二）维系键：次级键氢键范德华力疏水键离子键二硫键二、空间构象空间构象按的范围及复杂度分为二级结构三级结构四级结构

（三）二级结构1.定义指蛋白质分子中某段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象2.维系键氢键肽平面肽平面成为肽链盘曲折叠的基本单位

肽链以肽平面为单位可形成几种构型?α-螺旋β-折叠β-转角无规则卷曲

-螺旋-螺旋结构特点右手螺旋每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C＝O之间形成氢键侧链R分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成-折叠-折叠结构特点肽链相当伸展，肽平面之间折叠成锯齿状，相邻肽平面间呈110°角。氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C＝O与H形成氢键两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的.正、反平行能相互交替,平行的结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的结构，则间距为0.7nm。

β-转角四个AA残基的1位-CO-与4位-NH-形成氢键,造成180°回折,其封闭环含10个原子无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。

(四)超二级结构（基序）1.定义在许多蛋白质分子中，可发现两个或两个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合2.组合形式

；；

(四)超二级结构3.模体(motif)是具有特殊功能的超二级结构，它是由两个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构

（五）三级结构1.定义整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置.2.维系键次级键肌红蛋白(Mb)N端

C端

3.结构域(domain)在分子量较大的蛋白质分子中，多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠成一个或多个相对独立的致密区域，并各行使功能。

（六）四级结构1.亚基(subunit)有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链每一条多肽链都有完整的三级结构，称为亚基

。2.四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为四级结构。3.维系键氢键和离子键

血红蛋白(Hb)第三节蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein

一、一级结构与功能的关系1.一级结构是空间结构的基础天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性去除尿素、β-巯基乙醇

2.一级结构不同，生物学功能各异加压素Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly

缩宫素Cys-Tyr-Leu-Gln-Asn-Cys-Pro-Ile-Gly

收缩血管，升高血压，抗利尿子宫收缩，催产功能

3.一级结构相似的蛋白质，其基本构象及功能也相似垂体前叶分泌的促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(α-MSH,β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促进皮下黑色素生成，但作用较弱-甲硫-谷氨-组氨-苯丙氨-精氨-色氨-甘氨4.在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响。镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbS

β肽链HbA

β肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

二、空间构象与功能的关系蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。

1.蛋白质变性蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性

2.变构效应(allostery)小分子物质与蛋白质分子结合，导致其构象改变，并伴随其功能的变化，称为变构效应或别构作用。蛋白激酶PKARRCC

无活性

cAMP

有活性

3.蛋白质构象改变与疾病若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。

疯牛病朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)正常PrPc疯牛病PrPsc第四节蛋白质的性质TheCharactersofProtein

一、蛋白质分子大小、形状和

分子量的测定分子大小：1×104～106

Da形状：分子量测定方法不对称常数≈

1球形＞

1纤维状之间椭圆形分子筛层析法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳生物质谱

二、蛋白质变性(denaturation)1.定义在某些物理和化学因素作用下，特定的空间构象被破坏,从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。2.本质次级键破坏，不涉及一级结构的变化3.因素加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等

4.应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌高温蒸煮、照射紫外线、喷洒苯酚溶液、在伤口处涂抹酒精溶液等化验室，用加热凝固的方法检查尿中的蛋白质，如有，尿液变浑浊有机汞等重金属离子中毒时，可喝牛奶解其毒性保存蛋白质制剂（防止变性）:酶，疫苗，免疫血清，避免蛋白质变性，以防失活

5.变性蛋白改变的理化性质溶解度降低粘度增加结晶性破坏生物学活性丧失易被蛋白酶分解

6.复性(renaturation)变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。

三、蛋白质的两性电离和等

电点CHNH3+COO-RCHNH3+COO-R+H++OH-CHNH2COO-RCHNH2COO-RpH>pI阴离子pH=pI氨基酸的兼性离子

+OH-+H+CHCOOHRNH3+CHCOOHRNH3+pH<pI阳离子1.氨基酸的两性解离2.蛋白质可解离部分两端的游离氨基和羧基侧链中一些解离基(Glu、Asp、

Lys、

Arg和His)

3.蛋白质的等电点当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点4.判断依据

pH＞pI

负

pH＝pI

零

pH＜pI

正凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性思考

?一多肽为Ala-Arg-Gly-His-Arg-His-Ala-Arg-His,问当溶液pH值为7.0时.此多肽向电场哪极移动?答案:负Glu-His-Arg-Val-Lys-Asp肽段电泳时,在哪种pH下移向负极?()A.12B.3C.11D.5E.9

答:BD

四、胶体性质分子量颇大，介于一万到百万之间分子的大小已达到胶粒1～100nm范围之内胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜

五、蛋白质沉淀(precipitation)1.定义蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象本质水化膜和电荷因素被去除3.与蛋白质变性区别变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀+++++++带正电荷的蛋白质在等电点的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质水化膜酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱溶液中蛋白质的聚沉

4.蛋白质沉淀方法中性盐沉淀法有机溶剂沉淀法加热沉淀法重金属盐沉淀法生物碱沉淀法中性盐沉淀法盐溶作用低盐浓度可使蛋白溶解度增加的现象。盐析作用高盐浓度时，因破坏蛋白质分子表面的水化膜并中和电荷，而使蛋白质分子相互聚集从溶液中析出的现象。特点:沉淀蛋白不变性。有机溶剂沉淀机理破坏水化膜特点可引起蛋白变性丙酮沉淀而不变性的条件0～4℃低温，10倍体积，立即分离

六、呈色反应茚三酮反应(NinhydrinReaction)加热时，产生蓝紫色反应双缩脲反应(BiuretReaction)肽键反应，产生紫红色酚试剂反应酪氨酸，产生蓝色第五节蛋白质的分离纯化TheSeparationandPurificationofProtein提取分离纯化分析鉴定蛋白质分离纯化的方法（一）依据溶解度不同等电点沉淀盐析沉淀低温有机溶剂沉淀蛋白质分离纯化的方法（二）依据分子大小不同透析与超滤密度梯度离心凝胶过滤

1.透析与超滤透析利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法超滤应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的思考题将分子量分别为a（90000）、b（45000）和c（110000）的3种蛋白混合液过凝胶柱，洗脱顺序是

cab

3.超速离心既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子