土壤中分解尿素的细菌的分离与计数评优课用

1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶【课题背景】CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH33、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照研究思路包括哪些环节？

1、自然界中筛选菌株实例：启示：原因：DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株美国黄石国家公园的一个热泉因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物，只有Taq细菌被筛选出来。寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？方法：⑴抑制大多数微生物不能生长⑵造成有利于该菌生长的环境，2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。1.间接计数法（活菌计数法）每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M常用方法：稀释涂布平板法（1）原理：（2）计算：1个菌落1个活菌稀释度足够高固体培养基C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)M：稀释倍数二、统计菌落数目某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4

B两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）？乙：A组结果误差过大，意味着操作有误，不应用于计算平均值,需要重新实验（3）注意事项①选30∼300个菌落的平板统计③统计结果表示：每克样品中的菌落数④菌落数活菌的实际数＜②每个稀释度取3个平板取其平均值——重复实验2.显微镜直接计数：利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：

血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网。血球计数板的构造

注意事项取样时先要摇匀菌液；使用时先盖上盖玻片，再沿盖玻片边缘凹槽滴加菌液，让菌液自行渗入计数室；一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜；每个计数室选5个中格（4个角和中央）计数；位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左；血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，以免损坏网格刻度；洗净后自行晾干或吹风机吹干。1ml菌液中的总菌数=？

答案：(3+4+4+3+2)／5×25×104=8×105个/ml25中格X16小格1.目的（三）设置对照排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度（1）判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。（2）判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）与选择培养基同时接种后培养观察菌落数目。2.方法三.实验设计

（1）原理：尿素细菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分解成氨。（2）实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。（3）实验流程：土壤取样

样品系列稀释

涂布平板与培养

观察并记录结果菌落计数（4）实验的具体操作

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度㈢.样品的稀释原因：目的：不同微生物在土壤中含量不同保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。细菌：放线菌：霉菌：30～37℃培养1～2d25～28℃培养5～7d25～28℃的温度下培养3～4d。微生物的培养与观察四、操作提示

无菌操作

做好标记

规划时间

1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。对于耗时较长的实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。五.课外延伸

细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨使培养基的pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，如果指示剂变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现深紫色（或黑色），通过记数得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈绿色，有金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

本课题知识小结:1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）

A.在液体培养基上进行B.至少接种一种细菌

C.接种一个细菌D.及时补充消耗的营养物质2.使用选择培养基的目的是（）

A.培养细菌

B.培养真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素实践训练A

CD4.下列说法不正确的是（）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶

B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）

A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质

C.青霉素类药物D.高浓度食盐BC

6、测定土壤中细菌数量一般选104、105、106

倍的稀释液进行平板培养；而真菌的数量，一般选用102、103、104

倍稀释，其原因是

（）

A细菌个体小，真菌个体大

B细菌易稀释真菌不易稀释

C细菌在土壤中含量比真菌高

D随机的，没有原因7、用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（）

A.比实际值高

B.比实际值低

C.和实际值一致

D.比实际值可能高也可能低B8、某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4

B9、下列能选择出分解尿