人类基因组DNA提取

人类基因组DNA提取人类基因组人类基因组是由23对染色体（共46个）所构成，每一个染色体皆含有数百个基因，在基因与基因之间，会有一段可能含有调控序列和非编码DNA的基因间区段。人类拥有24种不同的染色体，其中有22个属于体染色体，另外还有两个能够决定性别的性染色体，分别是X染色体与Y染色体。基因组DNA是指生物细胞的染色体DNA，基因组DNA是没有组织特异性的，无论从何种人体组织制得的DNA都是一样的。人类基因组DNA主要存在于细胞核内，被组蛋白紧密地包装起来组成染色体。

1.真核生物DNA一般存在于细胞核染色体上以及线粒体上，基因组DNA一般又称核DNA。

2.哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。

3.原始材料较少或较难获得时，还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞;有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮细胞、发根细胞。产前诊断所用的材料为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞。提取基因组DNA原理基因组DNA提取主要步骤一、样品准备：1.生物组织：（1）最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存-70℃或液氮（2）液氮冷冻敲碎研磨（3）组织匀浆法（3）液氮匀浆法2.培养细胞悬浮生长细胞：1500g离心，4℃10分种收集细胞单层培养细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心收集3.血液样品不同组织细胞基因组DNA提取方法有所不同，分离方法也有所差异，但原理相似，因此他们具有共同的步骤：二、DNA提取不同方法：1.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯。2.甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，透析获得DNA。3.玻璃棒缠绕法：盐酸胍裂解细胞，裂解物铺于乙醇上，用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。4.异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）5.表面活性剂快速制备法：用TritonX-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。6.加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。7.碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。三、DNA的浓缩不同方法：1.固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量2.丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。3.乙醇或异丙醇沉淀：（1）需要阳离子盐的存在，醋酸钠最常用,NaCl对含SDS样品好，NH4Ac去除dNDP好。PiCl沉淀RNA好，但不能用于反转录前。（2）沉淀温度与时间；0℃一4℃，12000g，10分钟，小于100bpDNA需超速离心。4.精胺沉淀法：与DNA结合后使DNA结构凝缩沉淀，需在无盐或低盐溶液。四、DNA分离纯化总原则1、保证核酸一级结构完整2、排除其他分子的污染：细胞内：蛋白质、糖类、脂类、RNA等提取过程：有机溶剂、金属离子、外源DNA基因组DNA提取注意事项减少化学因素对核酸的降解：

如过量酸碱减少物理因素对核酸的降解：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融高温高压防止核酸的生物降解：核酸酶的预防常用方法：

人类外周血中提取基因组DNA方法从人全血中提取基因组DNA的方法人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组DNA方法无限增殖化人类B淋巴细胞基因组DNA提取方法从口腔上皮脱落细胞中提取实验材料与试剂材料：人口腔上皮细胞试剂：抽提缓冲液水饱和酚氯仿/异戊醇（V/V=24：1）75%乙醇、95%乙醇TE缓冲液实验操作步骤取材：用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，咀嚼，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。收集细胞沉淀。提取与纯化：加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至离心管，混匀，65°C温育30min。继续抽提缓冲液：由SDS,EDTA,蛋白酶K组成

SDS：SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。试验中用来裂解细胞。EDTA:一种重要的络合剂，能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性配合物。试验中用来络合镁等二价金属离子，防止DNA酶对DNA的降解作用。蛋白酶K:一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。返回分离蛋白质：加入等体积（0.5ml）的饱和酚，充分颠倒混匀（不要震荡）12000rpm*5min，上层水相转移至新的离心管加入等体积氯仿/异戊醇，等体积混匀12000rpm*5min（去除蛋白质和SDS沉淀），上层水相转移至新的离心管沉淀DNA：加入2倍体积95%乙醇颠倒混匀，12000rpm*10min试剂说明：酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质95%乙醇：沉淀DNA去盐：弃上清，沉淀中加入75%乙醇，12000rpm*2min轻轻去上清液，打开离心管室温静置5~10min储存DNA:1、短期储存：

4℃或-20℃存放于TE缓冲液中（TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年）。2、长期贮存在70%乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70℃保存。试剂说明：75%乙醇：去盐，洗涤DNA沉淀TE溶液：溶解DNA实验示意图DNA提取的应用1.人类基因组计划人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日该国和中国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序息。与曼哈顿计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。2.疾病基因的定位克隆人类基因组计划的直接动因是要解决包括肿瘤在内的人类疾病的分子遗传学问题。6000多个单基因遗传病和多种大面积危害人类健康的多基因遗传病的致病基因及相关基因，代表了对人类基因中结构和功能完整